本文關(guān)鍵詞：Aif-T18融合蛋白對(duì)TEM1陽(yáng)性細(xì)胞的體外殺傷效果評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的:惡性腫瘤的發(fā)病率近年來(lái)逐漸上升,嚴(yán)重威脅人體的生命和健康。雖然對(duì)癌癥的治療有手術(shù),放化療以及靶向治療等方法,但都有其固有的局限性。因此,尋找新的穩(wěn)定作用靶位,開發(fā)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的新型藥物具有重要的臨床意義。腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子1(TEM1)可在近乎所有實(shí)體瘤特別是卵巢癌相關(guān)細(xì)胞中大量表達(dá),而在正常細(xì)胞中不表達(dá)或者表達(dá)水平很低。因此,TEM1可以作為腫瘤血管治療的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用酵母抗體庫(kù)篩選分離出了可同時(shí)結(jié)合人類和鼠類TEM1的高親和力、特異性單鏈抗體(sc Fv T18)。本研究中,我們主要利用單鏈抗體sc Fv T18選擇性攜帶凋亡誘導(dǎo)因子AIF,靶向抑殺TEM1陽(yáng)性細(xì)胞,從而為Aif-T18融合蛋白在腫瘤治療中的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建p IRES-TEM1-EGFP重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染TEM1陰性細(xì)胞MS1并利用G418篩選出TEM1陽(yáng)性細(xì)胞系(MS1-TEM1);構(gòu)建p ET302-Aif和p ET302-Aif-T18(將sc Fv T18基因與AIF基因融合)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21中,IPTG誘導(dǎo)得到所需的目的蛋白,之后利用流式細(xì)胞技術(shù)和MTT檢測(cè)融合蛋白對(duì)MS1和MS1-TEM1細(xì)胞的親和力以及殺傷效果。結(jié)果:成功構(gòu)建了MS1-TEM1穩(wěn)定細(xì)胞系,細(xì)胞流式結(jié)果顯示:Aif-T18對(duì)MS1-TEM1細(xì)胞具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,靶向性良好;MTT結(jié)果顯示72 h后,Aif-T18對(duì)MS1-TEM1細(xì)胞具有很好的殺傷效果。結(jié)論:我們通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)得到的Aif-T18融合蛋白對(duì)MS1-TEM1細(xì)胞具有明顯的特異性殺傷效果,有望開發(fā)成為一種新型的抗腫瘤藥物。
【關(guān)鍵詞】：TEM1 實(shí)體瘤 單鏈抗體 AIF 腫瘤微環(huán)境
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R73-36
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 前言10-16
• 1.1 腫瘤的治療現(xiàn)狀10-11
• 1.2 ADC藥物治療11-13
• 1.3 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子 1（TEM1）研究現(xiàn)狀13-14
• 1.4 凋亡誘導(dǎo)因子 (APOPTOSIS-INDUCING FACTOR，AIF)研究現(xiàn)狀14-16
• 第2章 材料與方法16-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.1.1 試劑及試劑盒16-17
• 2.1.2 儀器設(shè)備17
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株和質(zhì)粒17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制17-19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法19-35
• 2.3.1 TEM1的原核表達(dá)19-23
• 2.3.2 重組質(zhì)粒p IRES-TEM1-EGFP的構(gòu)建23-28
• 2.3.3 MS1-TEM1細(xì)胞系的構(gòu)建28-29
• 2.3.4 p ET302-Aif-T18與p ET302-Aif重組質(zhì)粒的構(gòu)建29
• 2.3.5 p ET302-Aif-T18與p ET302-Aif蛋白的表達(dá)及純化29-31
• 2.3.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)重組蛋白對(duì)細(xì)胞的結(jié)合能力31-33
• 2.3.7 MTT技術(shù)檢測(cè)重組蛋白對(duì)細(xì)胞的毒力33-35
• 第3章 結(jié)果與分析35-42
• 3.1 TEM1原核表達(dá)結(jié)果35-36
• 3.2 TEM1陽(yáng)性細(xì)胞的構(gòu)建及驗(yàn)證36-38
• 3.2.1 p CMV6-XL4與p GEM? -3Zf(-)雙酶切結(jié)果36
• 3.2.2 p GEM-3ZF-TEM1與PIRES-EGFP雙酶切結(jié)果36-37
• 3.2.3 MS1-TEM1熒光顯微鏡圖37-38
• 3.2.4 p IRES-TEM1-EGFP轉(zhuǎn)染MS1和MS1-TEM1細(xì)胞Western Blot驗(yàn)證38
• 3.3 Aif-T18融合蛋白與Aif蛋白的構(gòu)建及驗(yàn)證38-42
• 3.3.1 p ET302-Aif-T18與p ET302-Aif重組質(zhì)粒的構(gòu)建38-39
• 3.3.2 Aif-T18融合蛋白與Aif蛋白表達(dá)、純化及驗(yàn)證39-40
• 3.3.3 Aif-T18融合蛋白，Aif蛋白與細(xì)胞的結(jié)合能力40-41
• 3.3.4 Aif-T18融合蛋白，Aif蛋白對(duì)細(xì)胞的殺傷力41-42
• 第4章 討論42-44
• 第5章 結(jié)論44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果49-50
• 綜述50-57
• 參考文獻(xiàn)55-57

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張志祥,姚其正;融合蛋白—— 一種新的生物工程技術(shù)[J];藥物生物技術(shù);2001年01期

2 李大鵬,王莉,衛(wèi)紅飛,張培因,吳秀麗,萬(wàn)敏,王燕媚,王愛麗,楊世杰,王麗穎;熱休克蛋白65-MUC1融合蛋白對(duì)小鼠干擾素γ產(chǎn)生細(xì)胞的誘生作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年03期

3 曲梅花;于繼云;胡美茹;王守訓(xùn);黎燕;;人CD28-Fc融合蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)與純化[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2005年05期

4 張榮媛;王靜;李茜;王航雁;;融合蛋白技術(shù)及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)際生物制品學(xué)雜志;2006年02期

5 何火聰;劉樹滔;潘劍茹;陳躬瑞;饒平凡;;GST-TAT-GFP融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年04期

6 嚴(yán)世榮;閆瑩;孫軍;宗義強(qiáng);王小波;屈伸;;TAT-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠生物膜穿透性的研究[J];藥物生物技術(shù);2007年05期

7 馬大龍,郭淑君,鄭蕾,陳慰峰;在大腸桿菌高效表達(dá)人白細(xì)胞介素4融合蛋白[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1990年04期

8 楊和平，黃宗之;融合蛋白的生產(chǎn)技術(shù)[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;1994年04期

9 廉德君,許根俊;一種改進(jìn)的融合蛋白親和層析純化方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1998年03期

10 李文平,許靜,隋建華,宋增璇;抗人纖維蛋白單鏈抗體-鏈親和素融合蛋白的穩(wěn)定性及對(duì)動(dòng)物纖維蛋白的識(shí)別[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;1999年09期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 祝強(qiáng);黃智華;黃予良;覃揚(yáng);;rhEPO-L-Fc融合蛋白的克隆、表達(dá)、生物活性分析及初步藥代動(dòng)力學(xué)研究[A];第九屆西南三省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2008年

2 高基民;呂建新;;白細(xì)胞介素15/鏈親和素融合蛋白的制備及活性測(cè)定[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

3 孫益;葛霽光;;人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和可溶性人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的融合蛋白的表達(dá)[A];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第六次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

4 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的表達(dá)及其免疫原性[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第四次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2005年

5 陳麗華;王強(qiáng);侯萬(wàn)國(guó);;不同鏈接劑修飾的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十二屆膠體與界面化學(xué)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 王榮智;汪世華;林文雄;;抗體與酶融合技術(shù)研究[A];第十屆全國(guó)殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)暨全國(guó)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化會(huì)議論文摘要集[C];2006年

7 劉忠華;丁元生;胡忠義;;結(jié)核分枝桿菌38kD-16kD融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)[A];2007年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

8 祖東;徐春曉;黃國(guó)錦;姚立紅;陳愛君;朱宏建;劉沐榮;張智清;;TNFRI∶IgGFc融合蛋白基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)[A];首屆長(zhǎng)三角科技論壇——長(zhǎng)三角生物醫(yī)藥發(fā)展論壇論文集[C];2004年

9 劉先俊;劉方欣;黎波;周輝云;王琴琴;;胸腺素α1與復(fù)合α干擾素融合蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)活性[A];第九屆西南三省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2008年

10 楊燕凌;;酶(蛋白)融合技術(shù)研究[A];華東地區(qū)農(nóng)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨福建省科協(xié)第七屆學(xué)術(shù)年會(huì)農(nóng)業(yè)分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2007年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 記者 朱敏麗　通訊員 潘越;中國(guó)醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[N];泰州日?qǐng)?bào);2010年

2 吳紅梅;我省首批融合蛋白試劑出口美國(guó)[N];新華日?qǐng)?bào);2010年

3 金陵;融合蛋白試劑首次出口美國(guó)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

4 記者 毛黎;美開發(fā)出癌癥治療新技術(shù)[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

5 常麗君;線粒體融合蛋白2決定細(xì)胞生死[N];科技日?qǐng)?bào);2013年

6 通訊員 沈季 記者 張兆軍;抗腫瘤融合蛋白進(jìn)入臨床試驗(yàn)[N];科技日?qǐng)?bào);2005年

7 記者 張曄　通訊員 劉寧春;一種有效治療冠心病的融合蛋白發(fā)現(xiàn)[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

8 ;吉大抗腫瘤生物工程新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

9 毛磊;新型抗流感藥物有望面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

10 曹麗君;英研制出新型抗流感藥物[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉星;赭曲霉毒素A納米抗體的免疫學(xué)檢測(cè)性能及分子作用機(jī)理研究[D];南昌大學(xué);2015年

2 吳芩;Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)與機(jī)理研究和蛋白質(zhì)雙模式成像探針的制備及應(yīng)用[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

3 錢凱;胰高血糖素樣肽-1與人血清白蛋白融合蛋白的設(shè)計(jì)與改造[D];江南大學(xué);2015年

4 司成業(yè);基于融合蛋白構(gòu)建智能超分子組裝體[D];吉林大學(xué);2016年

5 范季瀛;候選藥物重組融合蛋白VAS-TRAIL的研究[D];華東理工大學(xué);2016年

6 高冬芳;纖維素酶作為融合蛋白在大腸桿菌中的應(yīng)用及其分泌機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2016年

7 宋琳琳;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];上海交通大學(xué);2015年

8 劉寶平;家蠶表達(dá)的霍亂病毒B亞基融合蛋白防治1型糖尿病和阿爾茨海默癥研究[D];浙江大學(xué);2015年

9 周小虎;線粒體融合蛋白2在肝細(xì)胞肝癌中作用機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2016年

10 陸遠(yuǎn);EGFR靶向單鏈抗體制備及介導(dǎo)siRNA內(nèi)化NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 郭海強(qiáng);p53~(N239S)蛋白的表達(dá)與純化以及癌基因Kras~(G12D)與p53~(236S)促進(jìn)小鼠罹患肺癌[D];昆明理工大學(xué);2015年

2 胡湘云;新城疫病毒融合蛋白納米抗體的篩選與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 張銀閣;熒光標(biāo)記重組乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 彭金秀;結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染致T細(xì)胞功能障礙的研究及融合蛋白AEMD和LT70的構(gòu)建[D];蘭州大學(xué);2015年

5 崔連振;利用重組凝集素篩選腫瘤相關(guān)蛋白及其功能研究[D];浙江理工大學(xué);2016年

6 耿小雪;對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細(xì)胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達(dá)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

7 皇超英;NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆、表達(dá)及特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 張冬冬;IL-1RA-PEP融合蛋白功能及對(duì)缺血性再灌注腦損傷的治療作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

9 楊懿;長(zhǎng)效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表達(dá)與生物活性鑒定[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

10 米夢(mèng)丹;透明顫菌血紅蛋白作為可視化標(biāo)簽在蛋白純化過(guò)程中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：Aif-T18融合蛋白對(duì)TEM1陽(yáng)性細(xì)胞的體外殺傷效果評(píng)價(jià)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：416208