本文關(guān)鍵詞：rHSA-ONC促進(jìn)大鼠肝癌細(xì)胞RH-35凋亡的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)是一種天然的蛋白質(zhì),提取于北極豹蛙的卵母細(xì)胞和早期胚胎中,它有很強的殺傷力,在體內(nèi)外的許多腫瘤試驗中都得到了很好的體現(xiàn),是第一個進(jìn)入抗腫瘤臨床試驗的核糖核酸酶。目前,臨床試驗中所用的ONC均取自蛙卵和早期胚胎,其存在制備工藝復(fù)雜和獲取困難等問題,難以滿足臨床需要。本實驗室利用人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)的高表達(dá)特性,根據(jù)ONC(AF332139.1)及HSA(NM_000477.5)的基因序列,通過密碼子優(yōu)化及GC含量調(diào)整等方法設(shè)計并優(yōu)化rONC及其融合蛋白rHSA-ONC的基因序列,并在融合蛋白間插入不同長度的以Gly4Ser1為模板進(jìn)行重復(fù)的連接肽,得到了高表達(dá)的融合蛋白,簡稱rHSA-M(0,1,2,3)-ONC。為了研究本實驗室純化的rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC對肝癌細(xì)胞的殺傷作用,本實驗用不同濃度的rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC處理體外培養(yǎng)的大鼠肝癌細(xì)胞RH-35,通過磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法檢測不同處理組RH-35細(xì)胞的增殖率;Hoechst染色法檢測不同處理組RH-35細(xì)胞的活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期時相的分布和凋亡率;qRT-PCR和Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)BCL-2、BAX等基因和蛋白的表達(dá)變化;劃痕法檢測細(xì)胞遷移的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC作用于RH-35細(xì)胞后,細(xì)胞抑制率與藥物處理時間和濃度呈正相關(guān)(P0.05),rONC組細(xì)胞抑制率最高,rHSA-M0-ONC組的細(xì)胞抑制率最低;rONC組使細(xì)胞處于G0/G1期的比例較rHSA-M(0,1,2,3)-ONC組多,rONC組細(xì)胞凋亡率較rHSA-M(0,1,2,3)-ONC組明顯增加,rHSA-M0-ONC組的細(xì)胞凋亡率最低;rONC組和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC組均能使BCL-2表達(dá)下調(diào),BAX表達(dá)上調(diào);rONC組抑制細(xì)胞遷移的能力較rHSA-M(0,1,2,3)-ONC組高。綜上所述,rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC均能抑制RH-35細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)其凋亡,但對增殖的抑制作用和對凋亡的促進(jìn)作用存在差異。其中rONC的活性最強,rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的活性與連接肽長度有關(guān),隨著連接肽長度增加,融合蛋白對RH-35細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強;rONC和rHSA-M(0,1,2,3)-ONC可通過上調(diào)BAX表達(dá)和下調(diào)BCL-2表達(dá),從而促進(jìn)大鼠肝癌細(xì)胞RH-35凋亡,抑制增殖,其凋亡機制可能與BCL-2、BAX表達(dá)變化相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：豹蛙抗瘤酶 融合蛋白 大鼠肝癌細(xì)胞RH-35 增殖抑制 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-3
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 縮略詞表11-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-33
• 1.1 核糖核酸酶概述13-14
• 1.2 幾種常見的核糖核酸酶14-20
• 1.2.1 牛胰腺核糖核酸酶A(RNase A)14-15
• 1.2.2 牛蛙核糖核酸酶(RC-RNase)15
• 1.2.3 牛精核糖核酸酶(BS-RNase)15-16
• 1.2.4 血管生成素(Angiogenin,ANG)16-17
• 1.2.5 兩棲酶( Amphinase)17-18
• 1.2.6 豹蛙抗瘤酶(P30，onconase，ONC)18-20
• 1.3 豹蛙抗瘤酶(ONC)的研究現(xiàn)狀20-25
• 1.3.1 ONC的作用機理20-22
• 1.3.2 ONC與其它藥物的協(xié)同作用、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用22-23
• 1.3.3 ONC與細(xì)胞凋亡23
• 1.3.4 rONC的臨床應(yīng)用23-24
• 1.3.5 ONC的前景展望24-25
• 1.4 人血清白蛋白(HSA)的作用研究25-27
• 1.4.1 HSA的結(jié)構(gòu)25
• 1.4.2 HSA的理化性質(zhì)25-27
• 1.4.3 HSA的應(yīng)用27
• 1.5 融合蛋白的特點及應(yīng)用27-30
• 1.5.1 融合蛋白的概念27
• 1.5.2 融合蛋白的特點27-28
• 1.5.3 融合蛋白的應(yīng)用28-30
• 1.6 研究目的、意義和內(nèi)容30-33
• 1.6.1 研究目的30
• 1.6.2 研究意義30
• 1.6.3 研究內(nèi)容30-33
• 2 材料與方法33-43
• 2.1 主要耗材及儀器33-34
• 2.2 主要試劑及配制34-37
• 2.3 rONC及其融合蛋白的獲得37-38
• 2.3.1 rONC及其融合蛋白的構(gòu)建與表達(dá)37-38
• 2.3.2 rONC及其融合蛋白的層析38
• 2.4 大鼠肝癌細(xì)胞RH-35 的培養(yǎng)38
• 2.5 細(xì)胞活性檢測：磺酰羅丹明B比色法38-39
• 2.6 細(xì)胞生長狀態(tài)觀察: 普通光學(xué)顯微鏡39
• 2.7 細(xì)胞凋亡檢測：Hoechst33258染色法39
• 2.8 細(xì)胞凋亡檢測：AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法39-40
• 2.9 細(xì)胞周期檢測：流式細(xì)胞術(shù)(Flow-Cytometry)40
• 2.10 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)40-41
• 2.11 SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳41
• 2.12 蛋白免疫印跡(Western Blot)41-42
• 2.13 細(xì)胞遷移能力檢測：劃痕實驗法42
• 2.14 統(tǒng)計學(xué)分析42-43
• 3 結(jié)果43-51
• 3.1 rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC對RH-35 細(xì)胞活性的影響43-44
• 3.2 rONC和rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC對細(xì)胞生長狀態(tài)的影響44-45
• 3.3 Hoechst33258染 色和Annexin V-FITC/PI雙 染法流式檢測rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC對細(xì)胞凋亡的影響45-46
• 3.4 流式檢測rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC融合蛋白對細(xì)胞周期的影響46-47
• 3.5 rONC及rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC融合蛋白對細(xì)胞增殖/凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響47-48
• 3.6 rONC及其rHSA-M_(0,1,2,3)-ONC融合蛋白對RH-35 細(xì)胞遷移的影響48-51
• 4 討論51-55
• 結(jié)論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項目和發(fā)表的論文69-71
• 致謝71-72

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本文編號：415210