發(fā)布時(shí)間：2023-03-23 04:01

　　目的構(gòu)建可以分泌表達(dá)GPD1酶的畢赤酵母,并使用Profinia蛋白純化系統(tǒng)獲得純度90%以上的GPD1酶,擴(kuò)大GPD1酶的制備,以進(jìn)一步研究其在腫瘤中的功能及作為抗腫瘤靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用研究。方法提取人細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板通過PCR擴(kuò)增GPD1基因,PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pPICZα-C用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切,連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1;pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33中,篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),采用固化金屬親和層析(IMAC)純化分泌的目的蛋白。結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE鑒定,成功表達(dá)和純化了GPD1酶,純度達(dá)90%以上。結(jié)論本研究建立了畢赤酵母分泌表達(dá)GPD1酶的方法,可用于制備GPD1酶,為進(jìn)一步的腫瘤機(jī)制研究和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和儀器
    1.1 材料
    1.2 儀器
2 方法
    2.1 GPD1基因的PCR擴(kuò)增
    2.2 表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1的構(gòu)建
    2.3 電擊轉(zhuǎn)化pPICZα-C-gpd1及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定
    2.4 甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)GPD1
    2.5 重組GPD1酶的純化
    2.6 檢測(cè)純化蛋白的濃度
3 結(jié)果
    3.1 GPD1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
    3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1的構(gòu)建及鑒定結(jié)果
    3.3 酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果
    3.4 GPD1的表達(dá)和純化
    3.5 GPD1重組酶的產(chǎn)量
4 討論



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