肝癌被譽為“癌中之王”,是最常見的惡性腫瘤之一。中國每年新發(fā)肝癌患者約占全球一半以上,死亡率在所有惡性腫瘤中位列第二位,嚴重威脅人民的生命和健康。肝癌起病非常隱匿,早期無明顯癥狀。約80%的肝癌患者首診就已進入中晚期,5年生存率幾乎為零,而早期肝癌患者經(jīng)過治療,5年生存率可達60%以上。因此,早診早治是對抗肝癌的重要手段。甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）作為一種血清標志物,是診斷肝癌的常用指標。然而,AFP檢測的靈敏度較低,僅有60%～70%的早期肝癌患者AFP值呈陽性。同時,常規(guī)的影像學檢查,如B超和CT難以發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑小于2 cm或密度近似肝實質(zhì)的早期肝癌。因此,早期肝癌診斷仍面臨較高的假陰性率及漏診率。隨著科學的發(fā)展和進步,以液體活檢（Liquid biopsy）這種侵入式小、靈敏度高的腫瘤診斷技術(shù)應運而生。其中,循環(huán)miRNA分子標志物檢測已被寫入2019版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》,并被納入肝癌早期檢測和診斷臨床應用。然而,miRNA是一類長度較短的RNA單鏈分子,且學術(shù)界尚未確定一種合適的miRNA內(nèi)源性參照基因,極大地影響了其定量結(jié)果的準確性,也是一直限... 

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 研究背景
        1.1.1 肝癌早期診斷現(xiàn)狀
        1.1.2 肝癌miRNA分子標志物檢測及應用
        1.1.3 MiRNA檢測技術(shù)進展
        1.1.4 數(shù)字核酸擴增檢測技術(shù)發(fā)展和應用
        1.1.5 微流控數(shù)字等溫擴增技術(shù)
    1.2 研究意義
    1.3 研究內(nèi)容
    1.4 技術(shù)路線
    1.5 擬解決的關(guān)鍵問題
    1.6 可行性分析
    1.7 本章小結(jié)
第2章 用于miRNA快速檢測的鏈置換等溫擴增技術(shù)研究
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 主要試劑和材料
        2.2.2 實驗方法
            2.2.2.1 無背景熒光探針鏈置換擴增(BF-ESDA)系統(tǒng)的構(gòu)建
            2.2.2.2 BF-ESDA實時熒光定量分析
            2.2.2.3 真實樣本試驗
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 檢測原理
        2.3.2 新型無背景熒光探針設計
        2.3.3 BF-ESDA方法的驗證
        2.3.4 BF-ESDA最適反應體系的優(yōu)化和建立
            2.3.4.1 探針最適濃度優(yōu)化
            2.3.4.2 Vent (exo-) DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶最適濃度優(yōu)化
            2.3.4.3 最適反應溫度優(yōu)化
        2.3.5 BF-ESDA在單樣本多靶標檢測性能的分析
        2.3.6 BF-ESDA檢測靈敏度分析
        2.3.7 BF-ESDA檢測特異性分析
        2.3.8 真實樣本試驗
    2.4 本章小結(jié)
第3章 miRNA絕對定量的微流控數(shù)字鏈置換等溫擴增檢測系統(tǒng)研究
    3.1 引言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 主要試劑和配置方案
        3.2.2 儀器與設備
        3.2.3 實驗方法
            3.2.3.1 自吸分液式高通量芯片制備
            3.2.3.2 數(shù)字等溫擴增反應體系的配置
            3.2.3.3 芯片注樣與油封
            3.2.3.4 數(shù)字等溫擴增檢測和分析
            3.2.3.5 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 自吸分液式高通量微流控芯片設計與制備
        3.3.2 芯片進樣與油封試驗
        3.3.3 芯片防蒸發(fā)密封試驗
        3.3.4 芯片分液均一性試驗
        3.3.5 油液熱穩(wěn)定性試驗
        3.3.6 生物兼容性試驗
        3.3.7 微反應單元陰陽性結(jié)果的界定
        3.3.8 定量準確性和檢測靈敏度試驗
    3.4 本章小結(jié)
第4章 肝癌相關(guān)miRNA分子標志物篩選和鑒定
    4.1 引言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 主要試劑和儀器
        4.2.2 研究對象
        4.2.3 實驗方法
            4.2.3.1 miRNA目標分子篩選與鑒定方案
            4.2.3.2 臨床樣本收集和處理
            4.2.3.3 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及定量分析
            4.2.3.4 數(shù)據(jù)分析
            4.2.3.5 基因穩(wěn)定性分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 肝癌miRNA相關(guān)分子的篩選
        4.3.2 候選miRNA目標分子的定量分析
        4.3.3 潛在miRNA分子標志物和內(nèi)參基因的驗證
        4.3.4 肝癌miRNA分子標志物的診斷效能評價
        4.3.5 hsa-miR-4644穩(wěn)定性分析
            4.3.5.1 RT-qPCR定量分析
            4.3.5.2 軟件分析和評價
        4.3.6 單內(nèi)參基因與雙內(nèi)參基因組合的性能對比
        4.3.7 單內(nèi)參基因與雙內(nèi)參基因組合的穩(wěn)定性驗證
    4.4 本章小結(jié)
第5章 肝癌早期診斷模型的建立及應用評價
    5.1 引言
    5.2 實驗部分
        5.2.1 主要試劑和儀器
        5.2.2 研究對象
        5.2.3 研究方案
        5.2.4 實驗方法
            5.2.4.1 臨床樣本收集和處理
            5.2.4.2 總RNA提取與質(zhì)量檢測
            5.2.4.3 微流控數(shù)字等溫擴增試驗
            5.2.4.4 肝癌miRNA標志物診斷效能評價
            5.2.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 肝癌miRNA分子標志物表達水平分析
        5.3.2 miRNA分子標志物、AFP及其組合診斷效能分析
        5.3.3 肝癌早期診斷模型的建立
        5.3.4 肝癌早期診斷模型的臨床驗證
    5.4 本章小結(jié)
第6章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
第7章 創(chuàng)新點與不足
    7.1 創(chuàng)新點
    7.2 存在的不足
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文與取得的其他研究成果



本文編號：3728669