本文關(guān)鍵詞：TRIM67對胃癌細(xì)胞增殖及凋亡影響機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:三結(jié)構(gòu)域蛋白67(TRIM67)是三結(jié)構(gòu)域蛋白家族的其一個成員,它在胃癌中處于沉默或下調(diào)的狀態(tài),目前在胃癌中未見相關(guān)文獻(xiàn),其作用機(jī)制尚不明確。我們通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及流式細(xì)胞術(shù)等相關(guān)實驗技術(shù)驗證TRIM67與胃癌細(xì)胞的生長、凋亡等之間的關(guān)系。主要闡明該基因在胃癌中作為一個腫瘤抑制基因的生物學(xué)功能。方法:1選取21對香港中文大學(xué)威爾斯親王醫(yī)院的胃癌組織和癌旁正常組織樣本為實驗對象,運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)測定TRIM67基因在這21對樣本中的表達(dá)水平,并分析胃癌組織和癌旁正常組織中TRIM67的表達(dá)水平差異。2運用相關(guān)實驗技術(shù),(1)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)驗證TRIM67在胃癌細(xì)胞株(AGS、BGC823、MGC803、MKN1、MKN45、MKN74、SNU1、SNU638)中的表達(dá)水平;(2)運用亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite genomic sequencing,BGS)對相關(guān)胃癌細(xì)胞株中TRIM67啟動子序列進(jìn)行檢測;(3)應(yīng)用2u M濃度的5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza)對胃癌細(xì)胞株(AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638)去甲基化處理96小時后,通過RT-PCR檢測細(xì)胞株中的TRIM67的表達(dá)水平,并以未用5-Aza處理的對照組進(jìn)行對比。3構(gòu)建pc DNA3.1-2×Flag-TRIM67重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1,以pc DNA3.1-vector為對照組,G418篩選出AGS和MKN1穩(wěn)定細(xì)胞株后,分別以m RNA和蛋白質(zhì)水平檢測該胃癌細(xì)胞株過表達(dá)TRIM67后的表達(dá)。運用MTT實驗進(jìn)一步表明TRIM67對胃癌細(xì)胞株細(xì)胞生長活力的影響,并通過軟瓊脂克隆形成實驗驗證該基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長及集落形成能力的作用情況。以TRIM67表達(dá)較高的胃癌細(xì)胞株MKN74為基礎(chǔ),應(yīng)用sh RNA(short hairpin RNA)敲低TRIM67并獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。在m RNA水平檢測轉(zhuǎn)染該基因的表達(dá)情況,并運用MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測敲低TRIM67后對胃癌細(xì)胞增殖及集落形成的能力。4以胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-2×Flag-TRIM67的穩(wěn)定細(xì)胞株和pc DNA3.1-vector對照組的穩(wěn)定細(xì)胞株為基礎(chǔ),用碘化丙啶(PI)對胃癌細(xì)胞株進(jìn)行染色以流式細(xì)胞術(shù)檢測實驗組和對照組的細(xì)胞周期變化,運用Flowjo軟件分析TRIM67基因的與胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期的關(guān)系和作用。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4、P21和P27進(jìn)行檢測,以明確TRIM67對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的作用影響。5應(yīng)用Annexin V和7-AAD(7-amino-actinomycin)雙染過表達(dá)TRIM67的胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1,通過流式細(xì)胞術(shù)檢驗實驗組和對照組細(xì)胞凋亡的情況,對TRIM67基因影響胃癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步分析。并運用蛋白質(zhì)印跡法對細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白如活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP ribose polymerase,PARP)進(jìn)行檢測,驗證TRIM67對胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。結(jié)果:1胃癌組織及癌旁正常組織中TRIM67的表達(dá)變化選取21對胃癌組織及癌旁正常組織對TRIM67基因的m RNA水平的檢測發(fā)現(xiàn),實驗表明胃癌組織中TRIM67的表達(dá)較癌旁正常組織中該基因的表達(dá)水平下調(diào)(P0.01,n=21)。2 TRIM67在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)情況及其啟動子甲基化水平的關(guān)系我們首先在胃癌細(xì)胞株中對TRIM67基因m RNA水平的表達(dá)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)TRIM67在8個胃癌細(xì)胞株中7個細(xì)胞株(AGS、BGC823、MGC803、MKN45、MKN1、SNU1、SNU638)的表達(dá)沉默或明顯下調(diào),胃癌細(xì)胞株MKN74及人胃粘膜上皮細(xì)胞株(GES1)有一定表達(dá)水平,在正常胃粘膜上皮組織中表達(dá)正常。進(jìn)而我們用亞硫酸氫鹽測序法測定TRIM67啟動子序列的Cp G甲基化位點及甲基化程度。我們發(fā)現(xiàn)7條胃癌細(xì)胞株的TRIM67啟動子序列甲基化程度較高,而MKN74和GES1該基因的啟動子序列甲基化程度較低,而在胃正常上皮粘膜組織中未發(fā)現(xiàn)甲基化。我們應(yīng)用5-Aza對胃癌細(xì)胞株(AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638)進(jìn)行去甲基化處理,處理后發(fā)現(xiàn)TRIM67在這5條胃癌細(xì)胞株中重新表達(dá)或表達(dá)上調(diào)。3過表達(dá)或下調(diào)TRIM67對胃癌細(xì)胞生長的影響TRIM67在胃癌細(xì)胞株和組織的沉默說明該基因有可能是抑癌基因,我們通過TRIM67在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況,選取胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1。以RT-PCR和Western blot analysis以驗證TRIM67在AGS和MKN1的轉(zhuǎn)染效率。過表達(dá)TRIM67后,MTT實驗顯示改基因明顯抑制AGS(P0.0001)和MKN1(P0.0001)胃癌細(xì)胞株的細(xì)胞生長活力;同時軟瓊脂克隆形成實驗驗證了TRIM67能夠顯著的抑制AGS(P0.01)和MKN1(P0.01)的細(xì)胞生長能力及集落形成能力。為進(jìn)一步證明TRIM67對胃癌的抑制作用,因此我們運用RNAi技術(shù)在TRIM67表達(dá)較高的胃癌細(xì)胞株MKN74中敲除該基因,以穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行實驗,MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗證明敲除TRIM67后可促進(jìn)MKN74細(xì)胞的增殖能力(P0.01)及集落形成能力(P0.01)。4胃癌細(xì)胞株中TRIM67對細(xì)胞周期的作用為確定TRIM67抑制胃癌細(xì)胞的生長的機(jī)制,我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了TRIM67基因?qū)?xì)胞周期的影響。實驗表明在胃癌細(xì)胞株中過表達(dá)TRIM67能夠明顯增加G1期的細(xì)胞數(shù),相反在S期的細(xì)胞數(shù)是下降的。同時對流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的研究,我們應(yīng)用Western blot analysis驗證了過表達(dá)TRIM67后對相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的影響,結(jié)果顯示該基因能夠抑制Cyclin D1和CDK4的表達(dá),并且促進(jìn)了P21和P27的表達(dá),以阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。5 TRIM67對胃癌細(xì)胞凋亡的影響為驗證TRIM67與胃癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系,我們用流式細(xì)胞術(shù)對過表達(dá)TRIM67后的胃癌細(xì)胞株(Annexin V和7-AAD雙染)進(jìn)行凋亡檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AGS和MKN1胃癌細(xì)胞株中,AGS細(xì)胞株中過表達(dá)組的總凋亡數(shù)要大于空白對照組(P0.05),在MKN1細(xì)胞株中過表達(dá)組的早期凋亡數(shù)(P0.001)、晚期凋亡數(shù)(P0.05)大于對照組。同時AGS和MKN1細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TRIM67后,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白如活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP的表達(dá)以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1在胃癌組織中TRIM67m RNA表達(dá)水平要明顯低于癌旁正常組織。2 TRIM67基因的啟動子序列高度甲基化是導(dǎo)致該基因在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)沉默或下調(diào)的重要因素。3 TRIM67基因可能作為一個抑癌基因可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力。4研究顯示TRIM67通過抑制cyclin-D1和CDK4并上調(diào)P21和P27影響G1/S期阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。5同時TRIM67基因通過激活活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9及PARP誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：三結(jié)構(gòu)域蛋白67 甲基化 胃癌 細(xì)胞周期 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-23
• 結(jié)果23-25
• 附圖25-31
• 討論31-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 綜述 TRIM蛋白家族的結(jié)構(gòu)功能及其與腫瘤的關(guān)系43-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 個人簡歷55

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：TRIM67對胃癌細(xì)胞增殖及凋亡影響機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：348344