本文關鍵詞：甘草次酸影響自噬及Bcl-2抗凋亡抑制胃癌SGC7901細胞增殖，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)又稱甘草亭酸,屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物,是甘草的主要的活性物質之一。GA對人肝癌、宮頸癌、乳腺癌、早幼粒細胞白血病等腫瘤具有良好的抗癌活性,且作用機制與細胞凋亡有關,伴有抑凋亡蛋白基因Bcl-2的下降。研究發(fā)現(xiàn)GA還可以通過誘導自噬的機制來抑制腫瘤細胞的增殖。GA抑制胃癌細胞增殖的研究尚少,有報道GA及其衍生物能夠呈濃度和時間依賴性地抑制胃癌細胞BGC823和SGC7901的增殖,但抑制機制的研究較少。目的本文研究了GA在6.25~200μmol/L濃度范圍內,作用胃癌SGC7901細胞的時間達48 h時,對細胞增殖、凋亡和自噬的影響,為GA抑制胃癌細胞增殖作用及其分子機制提供了理論依據(jù)。方法1.細胞培養(yǎng):將胃癌SGC7901細胞接種在由濃度為10%的胎牛血清、100U/ml青霉素100U/ml鏈霉素雙抗以及RPMI1640培養(yǎng)基配制的完全培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。2.實驗分組:設實驗組1~7、陰性對照組和培養(yǎng)基調零組,實驗組1~7為培養(yǎng)細胞加入含GA的二甲基亞砜(DMSO)溶液,使GA的終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、150、200μmol/L,陰性對照組加入和終濃度GA相同體積的DMSO。3.MTT法檢測GA對胃癌SGC7901細胞增殖的影響:除實驗組1~7、陰性對照組外,還設培養(yǎng)基調零組,培養(yǎng)基調零組為無細胞的培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的SGC7901細胞,藥物作用48小時后,加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h;輕輕倒扣出培養(yǎng)液,加入DMSO溶液,避光并振搖15~30 min;酶標儀上測定波長為492 nm的吸光度值(OD)。每次實驗組1~7、陰性對照組和培養(yǎng)基調零組均設3個復孔,重復實驗3次。計算GA對腫瘤細胞的抑制率和IC50。4.流式細胞儀檢測GA對胃癌SGC7901細胞DNA和凋亡的影響:實驗組1~7和陰性對照組藥物作用SGC7901細胞48 h,碘化丙啶(PI)單染流式細胞儀檢測細胞DNA的情況;用Annexin V-FITC和PI染色后,流式細胞儀下檢測細胞凋亡的情況,以GA終濃度為IC50作用48 h的SGC7901細胞分別進行Annexin V-FITC和PI單染作為染色對照。5.Western Blot檢測GA對胃癌SGC7901細胞的自噬相關蛋白Beclin1、Lc-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的影響:提取實驗組和陰性對照組細胞的總蛋白,蛋白定量后,取30μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電壓200 V,時間60 min。電轉移至NC膜,電流300 m A,時間90 min。用5%脫脂牛奶封閉2h。對照預染蛋白Marker,裁取Beclin1、Lc-3、Bcl-2、β-actin條帶所處相關范圍的NC膜;分別與1:1000兔抗Beclin1、兔抗Lc-3、鼠抗β-actin和1:500的兔抗Bcl-2抗體室溫孵育2 h或4℃過夜;繼之,與1:3000的羊抗鼠Ig G或羊抗兔Ig G室溫搖育1 h;發(fā)光顯影法在Amersham Imager 600儀器記錄結果,用Image J軟件來檢測免疫印跡條帶的平均灰度。6.統(tǒng)計學處理:使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學的分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((?)±s)的形式表示,組間比較用方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.GA對胃癌SGC7901細胞增殖的影響:MTT法測定結果顯示,不同濃度的GA作用胃癌SGC7901細胞48 h后,對其增殖抑制的作用在12.5~100μmol/L之間有統(tǒng)計學差異(P0.05),且呈濃度依賴性,100~200μmol/L之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),IC50為74.25μmol/L。2.GA對胃癌SGC7901細胞自噬的影響:Western Blot結果顯示:與對照組相比,GA作用SGC7901細胞48 h后,自噬相關蛋白Beclin1的表達在6.25~50μmol/L濃度增加趨勢明顯,50μmol/L后逐漸減弱或消失;Lc-3的表達在6.25~100μmol/L濃度與對照組相似,100μmol/L后減弱或消失。3.GA對胃癌SGC7901細胞凋亡的影響:PI單染流式細胞儀結果顯示,不同濃度的GA對胃癌SGC7901細胞的DNA影響有差異,細胞的亞二倍體數(shù)量在12.5~150μmol/L之間逐漸增加,有統(tǒng)計學差異(P0.05),且呈濃度依賴性。Annexin V-FITC和PI染色流式細胞儀結果顯示,與對照組相比較,不同濃度的GA作用SGC7901細胞48 h后,細胞的早期凋亡、晚期凋亡和壞死數(shù)量不同,低于150μmol/L濃度作用細胞的早期凋亡率呈濃度依賴性增加,晚期凋亡和壞死率也呈增加趨勢。4.GA對胃癌SGC7901的Bcl-2蛋白表達的影響:Western Blot檢測結果顯示,與對照組相比,GA作用SGC7901細胞48 h后,Bcl-2蛋白的表達在6.25~100μmol/L濃度與對照組相似,100μmol/L后逐漸減弱。半定量分析顯示,Bcl-2蛋白的表達在濃度低于12.5μmol/L時有增加趨勢;高于12.5μmol/L后有濃度依賴性的遞減趨勢。結論1.GA能夠呈濃度依賴性地抑制胃癌SGC7901細胞的增殖,當GA濃度超過100μmol/L,抑制細胞增殖的效率下降。2.GA影響SGC7901細胞自噬有雙向性,低于IC50濃度的GA主要加速SGC7901細胞的自噬體形成,高于IC50濃度的GA減少SGC7901細胞自噬體的形成和數(shù)量。3.GA能劑量依賴性的促進胃癌SGC7901細胞的早期凋亡、晚期凋亡和壞死,且抑制率達到90%以后,細胞凋亡繼續(xù)增加;GA對SGC7901細胞Bcl-2的抗凋亡作用有雙向性,濃度低于17%的IC50時增強,高于17%的IC50時呈濃度依賴性減弱。
【關鍵詞】：甘草次酸 增殖抑制 凋亡 自噬 SGC7901
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-24
• 2 結果24-31
• 3 討論31-34
• 4 小結34-35
• 參考文獻35-39
• 綜述：甘草次酸的抗腫瘤作用及機制的研究進展39-55
• 參考文獻46-55
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況55-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

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