本文關鍵詞：miR-200c基因甲基化檢測方法的建立及其在乳腺癌標本中的應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA,其通過與靶m RNA的3’端非翻譯區(qū)結合,引起靶m RNA降解或者翻譯抑制,產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默,從而調(diào)控基因的表達。已有大量研究表明,miRNA基因的表達和蛋白編碼基因一樣受到表觀遺傳調(diào)控,其表達下調(diào)可能與miRNA啟動子區(qū)CpG島的甲基化有關。miR-200c是與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關的miRNA,盡管miR-200c基因的甲基化與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關,但限于miR-200c基因關鍵性CpG位點的確認尚存爭議,以及檢測方法的局限性,使得miR-200c基因的甲基化檢測在組織標本中的應用尚未得到普遍的開展。目的:確認miR-200c基因甲基化的的關鍵性CpG位點;建立miR-200c基因甲基化檢測的定性與定量MSP分析方法,并應用于乳腺癌組織標本的分析。方法:采用原位miRNA雜交技術檢測miR-200c在乳腺病變組織中的表達;去甲基化藥物5-Aza-Cd R對四種乳腺癌細胞株進行處理,qRT-PCR方法檢測乳腺癌細胞中miR-200c的表達水平;運用在線軟件預測miR-200c基因啟動子區(qū)的CpG島;亞硫酸氫鈉修飾后克隆測序?qū)?-Aza-Cd R處理的乳腺癌細胞株miR-200c基因CpG島11個CpG位點進行檢測;建立MSP與d HPLC方法檢測乳腺癌細胞株miR-200c基因CpG島甲基化水平;應用MSP定性與定量方法對乳腺癌癌灶組織和癌旁組織檢測miR-200c基因CpG島甲基化。結果:1、原位雜交結果顯示,乳腺癌組織中miR-200c表達與正常和良性乳腺病變組織相比,并無統(tǒng)計學差異;2、qRT-PCR結果顯示;與0μmol/L對照組相比,5μmol/L的5-Aza-Cd R處理組中BT549與MDA-MB-231細胞株的miR-200c水平明顯增高(p0.05),而MCF7與T47D細胞的miR-200c水平變化不大;3、網(wǎng)站預測結果顯示,在miR-200c編碼基因起始位點前316~170bp位置處有一長度為147bp的CpG島,包含11個CpG位點;4、亞硫酸氫鈉克隆測序結果顯示,0μmol/L的5-Aza-Cd R對照組中,miR-200c表達高的MCF7和T47D細胞株miR-200c基因11個CpG位點甲基化頻率與甲基化總頻率明顯低于miR-200c表達低的BT549和MDA-MB-231細胞株;5、建立的MSP與d HPLC方法驗證了miR-200c基因CpG島在MDA-MB-231細胞株中高甲基化與MCF7細胞株中低甲基化;6、乳腺癌組織定性和定量MSP結果分析提示,miR-200c基因的甲基化頻率在癌灶組與癌旁組中未見統(tǒng)計學差異。結論:1、miR-200c編碼基因起始位點前316~170bp位置處有一長度為147bp的CpG島,此區(qū)域為關鍵性甲基化區(qū)域,該區(qū)域的CpG位點甲基化狀態(tài)與miR-200c的表達有著緊密關聯(lián);2、建立的定性MSP與d HPLC方法能特異性區(qū)分乳腺癌細胞株miR-200c基因CpG島甲基化狀態(tài),為后續(xù)乳腺癌組織標本的檢測提供了便利。
【關鍵詞】：miR-200c 甲基化 CpG島 乳腺癌
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英縮略詞表10-12
• 第1章 引言12-14
• 第2章 實驗材料、儀器與試劑14-18
• 2.1 細胞、臨床標本和組織芯片14-15
• 2.2 主要儀器15-16
• 2.3 主要試劑16-18
• 第3章 實驗方法18-34
• 3.1 主要試劑的配制18-21
• 3.1.1 常規(guī)分子生物學試劑的配制18
• 3.1.2 原位雜交主要試劑的配制18
• 3.1.3 細胞培養(yǎng)主要試劑的配制18-19
• 3.1.4 真核細胞DNA提取所需試劑的配制19
• 3.1.5 PCR所需試劑和溶液的配制19-20
• 3.1.6 鹽析法提取組織DNA所需試劑的配制20
• 3.1.7 亞硫酸氫鈉法甲基化修飾DNA所需試劑的配制20-21
• 3.1.8 LB培養(yǎng)基的配制21
• 3.2 乳腺癌組織MIR-200C原位雜交21-22
• 3.3 細胞培養(yǎng)22-24
• 3.3.1 細胞復蘇22
• 3.3.2 細胞傳代22-23
• 3.3.3 細胞凍存23
• 3.3.4 細胞計數(shù)23
• 3.3.5 5-AZA-Cd R用藥實驗23-24
• 3.4 CPG島預測24
• 3.5 RNA提取、MIRNA逆轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量-PCR24-26
• 3.5.1 總RNA的提�。═rizol法）24-25
• 3.5.2 miRNA逆轉(zhuǎn)錄25
• 3.5.3 Real-time PCR25-26
• 3.6 真核細胞DNA的提取26
• 3.7 亞硫酸氫鈉甲基化修飾DNA26-27
• 3.8 TA克隆測序27-30
• 3.8.1 通用引物PCR、PCR產(chǎn)物的純化27-28
• 3.8.2 TA克隆28
• 3.8.3 PCR法鑒定陽性克隆28-29
• 3.8.4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳29
• 3.8.5 產(chǎn)物測序29
• 3.8.6 測序結果分析的相關軟件29-30
• 3.9 鹽析法從石蠟包埋組織中提取DNA30-31
• 3.10 定性MSP31
• 3.11 定量MSP31-32
• 3.12 建立DHPLC法檢測乳腺癌細胞與組織中的MIR-200C32
• 3.13 統(tǒng)計32-34
• 第4章 實驗結果34-42
• 4.1 乳腺組織芯片MIR-200C原位雜交34-35
• 4.2 5-AZA-CDR對四株乳腺癌細胞MIR-200C表達的影響35
• 4.3 MIR-200C編碼基因啟動子CPG島預測35-36
• 4.4 BCS方法檢測細胞MIR-200C編碼基因啟動子CPG島甲基化水平36-39
• 4.4.1 miR-200c編碼基因啟動子CpG島序列BSP引物設計36
• 4.4.2 miR-200c啟動子CpG島的BSP引物PCR擴增36-37
• 4.4.3 miR-200c編碼基因CpG島BSP引物擴增后TA克隆37
• 4.4.4 miR-200c編碼基因啟動子區(qū)BSP引物擴增后TA克隆測序分析37-39
• 4.5 定性MSP法驗證乳腺癌細胞MIR-200C基因啟動子區(qū)CPG島甲基化狀態(tài)39
• 4.6 DHPLC驗證乳腺癌細胞中MIR-200C啟動子區(qū)CPG島甲基化狀態(tài)39-40
• 4.7 乳腺組織標本MSP定性分析40
• 4.8 乳腺組織標本MSP定量分析40-42
• 第5章 討論42-46
• 第6章 結論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻48-51
• 綜述51-62
• 參考文獻60-62

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