本文關(guān)鍵詞：腫瘤微環(huán)境對濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,研究在肺腺癌發(fā)病進程中濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(follicular regulatory T cells,Tfr)比例的變化,并分析其與疾病狀態(tài)間的關(guān)系;在體外以Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清模擬腫瘤微環(huán)境,研究腫瘤微環(huán)境對Tfr細(xì)胞分化的影響,并探討IL-6在此過程中發(fā)揮的作用。方法:(1)利用皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞的方式構(gòu)建肺癌移植瘤小鼠模型。在肺腺癌發(fā)病進程中,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹壁引流淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg細(xì)胞、Tfr細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的比例,并分析Treg/Tfr細(xì)胞比值以及Tfh/Tfr細(xì)胞比值的變化情況。(2)免疫磁珠法分選正常小鼠脾臟來源的CD4+CD25+T細(xì)胞,與Lewis肺癌細(xì)胞進行transwell共培養(yǎng),以CD4+CD25+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)作為對照。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5和Bcl-6的表達情況,分析兩種細(xì)胞間可能存在的作用方式。(3)用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基分別將相同數(shù)量的鼠源性Lewis肺癌細(xì)胞、CT26結(jié)腸癌細(xì)胞以及MFC胃癌細(xì)胞在相同條件下進行培養(yǎng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測不同腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的表達水平。(4)免疫磁珠法分選正常小鼠脾臟來源的CD4+CD25+T細(xì)胞,每孔加入1/4總體積的Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清。其中實驗組Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清預(yù)先加入抗IL-6中和性抗體處理,用以抑制IL-6的生物學(xué)活性。對照組Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清不做任何預(yù)處理。培養(yǎng)72h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5和Bcl-6的表達情況(5)免疫磁珠法分選正常小鼠脾臟來源的CD4+CD25+T細(xì)胞,實驗組加入rm IL-6(10ng/ml)。培養(yǎng)72h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5、Bcl-6以及Foxp3的表達情況。(6)肺癌移植瘤小鼠尾部靜脈注射抗IL-6中和性抗體,以等體積PBS溶液作為對照,觀察腫瘤生長情況。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹壁引流淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg和Tfr細(xì)胞的比例,分析Treg/Tfr細(xì)胞比值的變化情況。結(jié)果:(1)隨著癌癥的發(fā)展進程,荷瘤小鼠腹壁引流淋巴結(jié)中Tfr細(xì)胞的比例不斷上升,且與野生型小鼠相比差異明顯(P0.01)。腫瘤組織中Tfr細(xì)胞比例在第14天時上升顯著,與第7天相比差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),在第21天時細(xì)胞比例下降。荷瘤小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg/Tfr細(xì)胞比值較野生型小鼠均明顯下降(P0.01)。荷瘤小鼠淋巴結(jié)中Tfh/Tfr細(xì)胞比值較野生型小鼠下降(P0.05)。該結(jié)果提示:腫瘤微環(huán)境可能促進Tfr細(xì)胞的分化,并且Tfh細(xì)胞與Tfr細(xì)胞比例失衡。(2)與對照組相比,CD4+CD25+T與Lewis肺癌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)組中CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5和Bcl-6的表達水平均出現(xiàn)明顯上調(diào)。該結(jié)果提示:Lewis肺癌細(xì)胞可以通過間接作用的方式誘導(dǎo)CD4+CD25+T細(xì)胞表達CXCR5和Bcl-6,以促進CD4+CD25+T細(xì)胞向Tfr細(xì)胞分化。(3)Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的表達水平最高(276.3±29.9 pg/ml),而CT26細(xì)胞和MFC細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的表達水平分別僅為(77.38±13.86pg/ml)和(145.8±32.6 pg/ml)。該結(jié)果說明:Lewis肺癌細(xì)胞具備大量分泌IL-6的能力,即以Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清模擬的腫瘤微環(huán)境中存在著高水平IL-6。(4)抗IL-6中和性抗體處理組CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5的表達水平與對照組相比明顯下降(P0.01),而Bcl-6的表達則無明顯變化。該結(jié)果提示:以Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清模擬的腫瘤微環(huán)境能夠促進Tfr細(xì)胞分化,并且CXCR5表達的上調(diào)與細(xì)胞培養(yǎng)上清中高水平的IL-6有關(guān)。(5)加入rm IL-6(10ng/ml)實驗組中CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5的表達水平與對照組相比明顯增加(P0.01),而Bcl-6和Foxp3的表達則無明顯變化。該結(jié)果提示:IL-6能夠促進CD4+CD25+T細(xì)胞上CXCR5的表達。(6)與PBS對照組相比,注射抗IL-6中和性抗體的荷瘤小鼠腫瘤生長速度減慢,淋巴結(jié)和脾臟腫大程度減輕。腹壁引流淋巴結(jié)和腫瘤組織中Tfr細(xì)胞比例下降(P0.05),Treg/Tfr細(xì)胞比值增大(P0.05)。該結(jié)果提示:肺癌移植瘤小鼠體內(nèi)IL-6的缺失可能會影響Tfr細(xì)胞的分化。結(jié)論:(1)隨著癌癥的發(fā)展進程,荷瘤小鼠體內(nèi)Tfr細(xì)胞的比例增加,Tfh細(xì)胞與Tfr細(xì)胞比例失衡。(2)腫瘤微環(huán)境促進CD4+CD25+T細(xì)胞向Tfr細(xì)胞分化。(3)IL-6促進CD4+CD25+T細(xì)胞CXCR5的表達。
【關(guān)鍵詞】：濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 腫瘤微環(huán)境 分化 白細(xì)胞介素-6
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 緒論15-27
• 1.1 Treg細(xì)胞15-16
• 1.1.1 Treg細(xì)胞的概述15
• 1.1.2 Treg細(xì)胞的功能15
• 1.1.3 Treg細(xì)胞與腫瘤的相互作用15-16
• 1.2 Tfr細(xì)胞16-21
• 1.2.1 Tfr細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)16
• 1.2.2 Tfr細(xì)胞的表型16-17
• 1.2.3 Tfr細(xì)胞的來源17-18
• 1.2.4 Tfr細(xì)胞的分化18-20
• 1.2.5 Tfr細(xì)胞的功能20-21
• 1.3 Tfh細(xì)胞21-24
• 1.3.1 Tfh細(xì)胞的概述21-22
• 1.3.2 Tfh細(xì)胞的分化22
• 1.3.3 Tfh細(xì)胞的功能22-23
• 1.3.4 Tfh細(xì)胞與腫瘤的相互作用23-24
• 1.5 本研究的目的、方法、設(shè)計及意義24-27
• 1.5.1 研究目的24
• 1.5.2 研究方法24
• 1.5.3 研究方案設(shè)計24-26
• 1.5.4 研究意義26-27
• 第二章 肺癌移植瘤小鼠體內(nèi)Tfr細(xì)胞的變化情況27-38
• 2.1 實驗儀器和材料27-29
• 2.1.1 實驗儀器27-28
• 2.1.2 實驗材料28
• 2.1.3 實驗試劑28-29
• 2.1.4 實驗動物29
• 2.1.5 主要溶液配制29
• 2.2 實驗方法29-31
• 2.2.1 Lewis肺癌移植瘤小鼠模型的建立29
• 2.2.2 小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的分離29-30
• 2.2.3 小鼠腫瘤組織的消化和分離30
• 2.2.4 FCM檢測小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg細(xì)胞、Tfr細(xì)胞、Tfh細(xì)胞的比例30-31
• 2.2.5 圖像與統(tǒng)計學(xué)分析31
• 2.3 實驗結(jié)果31-36
• 2.3.1 各組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg細(xì)胞比例的變化31-32
• 2.3.2 各組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Tfr細(xì)胞比例的變化32-34
• 2.3.3 各組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg/Tfr細(xì)胞比值的變化34
• 2.3.4 各組小鼠淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞比例的變化34-35
• 2.3.5 各組小鼠淋巴結(jié)中Tfh/Tfr細(xì)胞比值的變化35-36
• 2.4 討論36-38
• 第三章 Tfr細(xì)胞體外分化的初步研究38-52
• 3.1 實驗儀器和材料38-40
• 3.1.1 實驗儀器38-39
• 3.1.2 實驗材料39
• 3.1.3 實驗試劑39-40
• 3.1.4 實驗動物40
• 3.1.5 主要溶液配制40
• 3.2 實驗方法40-44
• 3.2.1 免疫磁珠法分離小鼠脾臟CD4~+CD25~+T細(xì)胞40-42
• 3.2.2 CD4~+CD25~+T細(xì)胞與Lewis肺癌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)42-43
• 3.2.3 ELISA檢測腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 的表達水平43
• 3.2.4 Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 對Tfr細(xì)胞分化的影響43-44
• 3.2.5 rmIL-6 對Tfr細(xì)胞分化的影響44
• 3.2.6 圖像與統(tǒng)計學(xué)分析44
• 3.3 實驗結(jié)果44-50
• 3.3.1 免疫磁珠法分選CD4~+CD25~+T細(xì)胞的純度鑒定44-45
• 3.3.2 Transwell共培養(yǎng)檢測Lewis肺癌細(xì)胞對CD4~+CD25~+T細(xì)胞的影響45-46
• 3.3.3 ELISA檢測不同腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 的表達水平46-47
• 3.3.4 Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6 對Tfr細(xì)胞分化的影響47-48
• 3.3.5 IL-6 促進CD4~+CD25~+T細(xì)胞上CXCR5的表達48-50
• 3.4 討論50-52
• 第四章 IL-6 對肺癌移植瘤小鼠體內(nèi)Tfr細(xì)胞的影響52-63
• 4.1 實驗儀器和材料52-54
• 4.1.1 實驗儀器52-53
• 4.1.2 實驗材料53
• 4.1.3 實驗試劑53
• 4.1.4 實驗動物53-54
• 4.1.5 主要溶液配制54
• 4.2 實驗方法54-56
• 4.2.1 Lewis肺癌移植瘤小鼠模型的建立與分組處理54
• 4.2.2 小鼠腫瘤生長變化曲線的測量54-55
• 4.2.3 小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的分離55
• 4.2.4 小鼠腫瘤組織的消化和分離55
• 4.2.5 FCM檢測小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg細(xì)胞和Tfr細(xì)胞的比例55-56
• 4.2.6 圖像與統(tǒng)計學(xué)分析56
• 4.3 實驗結(jié)果56-62
• 4.3.1 小鼠腫瘤組織的體積及重量56-57
• 4.3.2 小鼠淋巴結(jié)、脾臟及腫瘤組織的大體觀察57-58
• 4.3.3 不同處理組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg細(xì)胞比例的變化58-60
• 4.3.4 不同處理組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Tfr細(xì)胞比例的變化60-61
• 4.3.5 不同處理組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織中Treg/Tfr細(xì)胞比值的變化61-62
• 4.4 討論62-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-73
• 致謝73-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章及科研成果74

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