本文關(guān)鍵詞：LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)調(diào)控及其功能機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,我國乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的速度遞增,成為威脅女性最常見的惡性腫瘤。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。LIN28作為高度保守的RNA結(jié)合蛋白,在多種腫瘤中存在廣泛的異位表達(dá),且有研究發(fā)現(xiàn),LIN28過度表達(dá)是腫瘤患者不良預(yù)后的強(qiáng)大預(yù)測指標(biāo)。本文通過研究LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)以及LIN28A對乳腺癌細(xì)胞的影響,探討LIN28A誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生EMT以及對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡調(diào)控機(jī)制。方法:1 首先利用實時定量PCR對浸潤性乳腺癌組織中LIN28A、OCT4、E-cadherin和Vimeatin進(jìn)行檢測,明確它們的表達(dá)情況,其次利用免疫組織化學(xué)法,分析LIN28A的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,以期明確在浸潤性乳腺癌中LIN28A與EMT相關(guān)因子及OCT4的關(guān)系,最后通過TUNNEL實驗檢測石蠟組織切片中細(xì)胞凋亡的情況,探究LIN28A對細(xì)胞凋亡的影響。2 體外實驗通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)LIN28A的MCF-7細(xì)胞系,研究LIN28A對乳腺細(xì)胞特性的影響,其中包括流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒轉(zhuǎn)染效率,Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力,克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況。最后,通過Real-time和Western-blot實驗檢測各相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況,明確乳腺癌細(xì)胞中LIN28A對癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:1 Real-time實驗結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,在浸潤性乳腺癌組織中LIN28A、OCT4、Vimeatin高表達(dá),E-cadherin低表達(dá)。并且LIN28A與OCT4表達(dá)正相關(guān)(R=0.332,P0.05),Vimeatin表達(dá)正相關(guān)(R=0.38,P0.05),與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)(R=-0.34,P0.05),E-cadherin與Vimeatin表達(dá)也成負(fù)相關(guān)(R=-0.353,P0.05);2免疫組織化學(xué)實驗表明,LIN28A表達(dá)與浸潤性乳腺癌腫瘤的大小、病理分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。并且LIN28A與OCT4表達(dá)正相關(guān)(R=0.423,P0.05),與Vimeatin表達(dá)正相關(guān)(R=0.364,P0.05),與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)(R=-0.533,P0.05),E-cadherin與Vimeatin表達(dá)也成負(fù)相關(guān)(R=-0.453,P0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,患者低LIN28A表達(dá)水平存活顯著長于那些高LIN28A表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.021),表明,在浸潤性乳腺癌中,LIN28A與患者的不良臨床預(yù)后相關(guān);3 TUNNEL實驗顯示,高表達(dá)LIN28A的乳腺癌組織中,細(xì)胞凋亡減少;4 Puromycin篩選出穩(wěn)定表達(dá)LIN28A的MCF-7細(xì)胞株,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)感染率,用400μl病毒液感染293T細(xì)胞,control-p SBbi-GP和LIN28A-p SBbi-GP的感染效率為13.1%、12.6%。800μl病毒液感染293T細(xì)胞,control-p SBbi-GP和LIN28A-p SBbi-GP的感染效率為20.1%、19.5%。由于轉(zhuǎn)染效率太低,故用病毒原液感染MCF-7細(xì)胞,control-p SBbi-GP和LIN28A-p SBbi-GP的感染效率為29.6%、24.8%。;5用Real-time和Western-blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)后LIN28A的表達(dá)情況,首先Real-time檢測LIN28A和let-7a的表達(dá),從實驗結(jié)果可以看出,與control-p SBbi-GP和parental相比,LIN28A-p SBbi-GP中LIN28A mRNA表達(dá)升高,而let-7a mRNA表達(dá)降低(P0.05)。隨后通過Western-blot實驗檢測LIN28A蛋白水平的表達(dá),同樣是與control-p SBbi-GP和parental相比,LIN28A-p SBbi-GP中LIN28A表達(dá)升高(P0.05);6克隆形成實驗研究細(xì)胞增殖的變化,本實驗結(jié)果顯示,parental組、control-p SBbi-GP組和LIN28A-p SBbi-GP組的克隆數(shù)分別為38.20±2.02、44.55±2.67和102.65±9.87,與parental組和control-p SBbi-GP組相比,LIN28A-p SBbi-GP克隆數(shù)顯著增加(P0.05),control-p SBbi-GP組與parental組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示過表達(dá)LIN28A基因可以促進(jìn)細(xì)胞增殖;7 Transwell實驗結(jié)果顯示,在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,與parental組和control-p SBbi-GP組相比,LIN28A-p SBbi-GP組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.05),提示過表達(dá)LIN28A基因可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力;8 FCM檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化,結(jié)果顯示,與parental組和control-p SBbi-GP組相比,LIN28A-p SBbi-GP組細(xì)胞早期凋亡率顯著降低(P0.05),并且,過表達(dá)LIN28A基因后,G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增多;9 Real-time和Western-blot實驗結(jié)果表明,與parental組和control-p SBbi-GP組相比,LIN28A-p SBbi-GP組MCF-7細(xì)胞Snail和Slug表達(dá)上調(diào),Cyclin D1和e IF4E表達(dá)上調(diào),Bcl-XL表達(dá)上調(diào),這表明過表達(dá)LIN28A可能通過抑制let-7誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡;10進(jìn)一步研究LIN28A與OCT4的關(guān)系,通過Real-time和Western-blot實驗發(fā)現(xiàn),過表達(dá)LIN28A后,OCT4表達(dá)增加,E-cadherin表達(dá)減少,Vimtern表達(dá)增加,提示,LIN28A也可以通過誘導(dǎo)OCT4的表達(dá),促進(jìn)乳腺癌EMT的進(jìn)程。結(jié)論:1 LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)負(fù)相關(guān)與Vimentin的表達(dá)正相關(guān),提示LIN28A可能通過EMT促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,并且LIN28A高表達(dá)是患者不良預(yù)后的獨立因素。2 通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)LIN28A,我們發(fā)現(xiàn)LIN28A過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞的凋亡,使細(xì)胞阻滯在S期,同時,通過檢測let-7相關(guān)的靶基因,發(fā)現(xiàn)LIN28A可以通過LIN28/Let-7/HMGA2/Slug、Snail/E-cadherin和LIN28/let-7/BCL-XL途徑,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡,此外,結(jié)合先前的研究,我們通過Real-time和Western-blot實驗發(fā)現(xiàn),過表達(dá)LIN28A后,OCT4表達(dá)增加,E-cadherin表達(dá)減少,Vimtern表達(dá)增加,提示,LIN28A也可以通過誘導(dǎo)OCT4的表達(dá),促進(jìn)乳腺癌EMT的進(jìn)程。為乳腺癌的治療提供了新的靶點。
【關(guān)鍵詞】：浸潤性乳腺癌 LIN28A 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 OCT4 腫瘤干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 引言11-13
• 第一部分 LIN28A在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系13-34
• 前言13-15
• 材料與方法15-22
• 結(jié)果22-23
• 附圖23-27
• 附表27-29
• 討論29-31
• 小結(jié)31-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二部分 LIN28A對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究34-66
• 前言34-36
• 材料與方法36-48
• 結(jié)果48-50
• 附圖50-58
• 附表58-60
• 討論60-62
• 小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 綜述 LIN28/let-7對惡性腫瘤的調(diào)節(jié)66-79
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Ting-Ting Li;Shuji Ogino;Zhi Rong Qian;;Toll-like receptor signaling in colorectal cancer:carcinogenesis to cancer therapy[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期

  本文關(guān)鍵詞：LIN28A在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)調(diào)控及其功能機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304331