本文關(guān)鍵詞：抗人肝癌干細(xì)胞功能性單抗的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其死亡率位居惡性腫瘤的第三位[1]。腫瘤治療失敗導(dǎo)致高死亡率的根本原因是轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)[2]。近年來(lái)的研究證明腫瘤干細(xì)胞在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此,靶向腫瘤干細(xì)胞的治療新策略,有望降低腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥,提高療效,降低死亡率。 本研究首先選擇轉(zhuǎn)移能力不同的2株肝癌細(xì)胞系Be17402-V3和HepG2,采用無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)(sphere培養(yǎng))具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞。應(yīng)用流式免疫熒光和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了PKH26、ESA、CD44、CD133、CD117等12種干細(xì)胞標(biāo)志物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Be17402-V3肝癌細(xì)胞系中ESA+和CD44+兩種表型的細(xì)胞在sphere培養(yǎng)細(xì)胞中被明顯富集,表明他們可能是肝癌干細(xì)胞。在HepG2細(xì)胞中,只有CD117+細(xì)胞可能是肝癌干細(xì)胞。采用流式熒光分選技術(shù)從2株肝癌細(xì)胞系中分別分選ESA+、CD44+及CD117+細(xì)胞經(jīng)體外sphere培養(yǎng),侵襲能力和耐藥性測(cè)定以及裸鼠體內(nèi)致瘤性檢測(cè)等研究,發(fā)現(xiàn)ESA+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞自我更新能力、高侵襲性、高耐藥性和在裸鼠體內(nèi)高致瘤性的特征,是肝癌細(xì)胞系Be17402-V3中的肝癌干細(xì)胞,ESA是肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。用同樣的技術(shù)首次在細(xì)胞系HepG2中也證明CD117+細(xì)胞是肝癌干細(xì)胞,CD117是肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。至此,我們成功地建立了肝癌干細(xì)胞的體內(nèi)成瘤細(xì)胞模型,為研究抗人肝癌干細(xì)胞抗體奠定了重要基礎(chǔ)。 在成功建立肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞模型及體內(nèi)成瘤模型的基礎(chǔ)上,我們對(duì)前期篩選獲得的抗人肝癌干細(xì)胞的2株單抗15D2和15B7進(jìn)行了生物學(xué)特性及單抗靶向肝癌干細(xì)胞治療肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。首先采用雙色免疫熒光及雙色流式熒光檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),15D2單抗能與肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物ESA、PKH26共染,表明該抗體識(shí)別的是肝癌干細(xì)胞。流式分選獲得的15D2+細(xì)胞經(jīng)體外sphere培養(yǎng)、侵襲性、耐藥性及體內(nèi)致瘤性檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)15D2+細(xì)胞與15D2細(xì)胞比較,具有高度自我更新、高耐藥性和裸鼠體內(nèi)高致瘤性的腫瘤干細(xì)胞特征,證明15D2單抗是抗肝癌干細(xì)胞的特異性單抗。體外功能研究結(jié)果顯示,15D2單抗能顯著抑制肝癌干細(xì)胞的增殖和遷移侵襲功能.抑制率分別達(dá)41.7%、35%和11.9%,表明15D2單抗是抗人肝癌干細(xì)胞的功能性抗體。15D2單抗靶向肝癌干細(xì)胞治療肝癌的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,接種腫瘤細(xì)胞2個(gè)月,停藥1個(gè)月時(shí),高、中、低劑量的15D2單抗治療組抑制肝癌生長(zhǎng)的抑制率分別為82.6%、71.4%和60%,單抗高劑量聯(lián)合化療藥順鉑治療的抑制率為91%,但單用化療藥順鉑的抑制率為56.7%,而且近3周單用化療組腫瘤生長(zhǎng)加快,顯示腫瘤復(fù)發(fā),這些結(jié)果表明抗肝癌干細(xì)胞單抗高劑量聯(lián)合化療組治療效果顯著優(yōu)于單用化療藥,并略?xún)?yōu)于單用抗體組,表明15D2單抗靶向肝癌干細(xì)胞,不僅能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng),而且還能治療腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥,這些結(jié)果讓我們看到靶向腫瘤干細(xì)胞治療有望通過(guò)抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,突破耐藥而減少死亡率延長(zhǎng)生存期的希望。 采用同樣的技術(shù)路線(xiàn)和方法,我們也證明了抗人肝癌干細(xì)胞單抗15B7是抑制識(shí)別人肝癌干細(xì)胞的單抗,15B7+細(xì)胞具有肝癌干細(xì)胞的高度自我更新、高侵襲等腫瘤干細(xì)胞的特征。體外功能研究也證明,15B7單抗能顯著抑制肝癌干細(xì)胞的sphere增殖及成球生長(zhǎng),其抑制率分別達(dá)50.3%和32.4%抑制遷移侵襲的抑制率達(dá)7.8%,表明15B7單抗也是一株抗人肝癌干細(xì)胞的功能性單抗。
【關(guān)鍵詞】：肝癌細(xì)胞系 肝癌干細(xì)胞 抗人肝癌干細(xì)胞功能性單抗 抗體靶向治療
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 圖表索引7-10
• 英文~.略詞10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 文獻(xiàn)綜述15-23
• 前言23-26
• 材料與方法26-40
• 一、實(shí)驗(yàn)材料26-32
• 1.細(xì)胞26
• 2.動(dòng)物26-27
• 3.主要試劑27-30
• 3.1 抗體27-28
• 3.2 常用試劑及材料28-30
• 4.主要儀器與設(shè)備30
• 5.計(jì)算機(jī)分析軟件30-31
• 6.主要自配試劑及其配方31-32
• 二、實(shí)驗(yàn)方法32-40
• 1.肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)32
• 1.1 人肝癌細(xì)胞系Bel7402-V3的傳代與培養(yǎng)32
• 1.2 人肝癌細(xì)胞系HepG2的傳代與培養(yǎng)32
• 2.肝癌干細(xì)胞相關(guān)亞群的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)(sphere培養(yǎng))32
• 3.雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)32
• 4.PKH26染色32-33
• 5.流式細(xì)胞術(shù)分析或分選33
• 6.雙色流式熒光分析或分選33-34
• 7.細(xì)胞免疫熒光34
• 8.雙色細(xì)胞免疫熒光34
• 9.原位細(xì)胞免疫熒光34-35
• 10.免疫組織化學(xué)檢測(cè)35
• 11.肝癌干細(xì)胞體外生物學(xué)特征的分析35-37
• 11.1 自我更新能力檢測(cè)35
• 11.2 增殖能力檢測(cè)35-36
• 11.3 耐藥能力檢測(cè)36
• 11.4 侵襲能力檢測(cè)36-37
• 12.肝癌干細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的分析37
• 13.抗肝癌干細(xì)胞單抗對(duì)肝癌干細(xì)胞生物學(xué)功能影響的分析37-38
• 13.1 抑制自我更新能力的檢測(cè)37
• 13.2 抑制侵襲能力的檢測(cè)37-38
• 13.3 抑制遷移能力的檢測(cè)38
• 14.單抗靶向肝癌干細(xì)胞治療肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究38
• 15.疏水層析純化IgM抗體38-39
• 16.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39-40
• 第一部分 人肝癌干細(xì)胞的分離與鑒定40-65
• 一、前言40-42
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-61
• (一) 人肝癌細(xì)胞系Bel7402-V3中腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定42-54
• 1、PKH26染色檢測(cè)肝癌干細(xì)胞42-43
• 2、流式熒光檢測(cè)sphere細(xì)胞中肝癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物43
• 3、雙色流式熒光檢測(cè)ESA~+CD44~+細(xì)胞在sphere細(xì)胞中的富集43-44
• 4、ESA~+CD44~+細(xì)胞的自我更新能力分析44-46
• 5、ESA~+CD44~+細(xì)胞的侵襲能力分析46-47
• 6、ESA~+CD44~+細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力分析47-48
• 7、PKH26染色檢測(cè)球形生長(zhǎng)的腫瘤干細(xì)胞ESA的表達(dá)48-49
• 8、ESA~+細(xì)胞的自我更新能力分析49-50
• 9、ESA~+細(xì)胞的耐藥能力分析50-52
• 10、ESA~+細(xì)胞的侵襲能力分析52-53
• 11、ESA~+細(xì)胞的致瘤能力分析53-54
• (二) 人肝癌細(xì)胞系HepG2腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定54-61
• 1、sphere培養(yǎng)及PKH26染色檢測(cè)肝癌千細(xì)胞54
• 2、流式熒光檢測(cè)sphere細(xì)胞中肝癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物54-55
• 3、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CD117~+細(xì)胞在sphere細(xì)胞中的富集55-56
• 4、CD117~+細(xì)胞的自我更新能力的檢測(cè)分析56-57
• 5、CD117~+細(xì)胞體外增殖能力檢測(cè)57-58
• 6、CD117~+細(xì)胞的耐藥能力檢測(cè)58-59
• 7、CD117~+細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)的成瘤能力分析59-61
• 三、討論61-64
• 四、小結(jié)64-65
• 第二部分 抗肝癌干細(xì)胞單抗的研究65-93
• 一、前言65-69
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-88
• (一) 抗人肝癌干細(xì)胞單抗15D2的研究69-81
• 1、PKH26檢測(cè)15D2單抗識(shí)別肝癌干細(xì)胞69-70
• 2、流式熒光檢測(cè)15D2~+細(xì)胞在sphere細(xì)胞中的富集70
• 3、雙色免疫熒光檢測(cè)15D2識(shí)別ESA~+的肝癌干細(xì)胞70-71
• 4、雙色流式熒光檢測(cè)15D2和ESA雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例71-72
• 5、15D2~+細(xì)胞的自我更新能力檢測(cè)72-73
• 6、15D2~+細(xì)胞的耐藥性分析73-74
• 7、15D2~+細(xì)胞的致瘤能力分析74-75
• 8、15D2單克隆抗體的純化75
• 9、15D2單抗抑制肝癌干細(xì)胞增殖能力的比較75-76
• 10、15D2單抗抑制肝癌干細(xì)胞的侵襲能力76-77
• 11、15D2單抗抑制肝癌干細(xì)胞的遷移能力77-78
• 12、15D2單抗靶向肝癌干細(xì)胞治療肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究78-81
• (二) 抗人肝癌干細(xì)胞單抗15B7的研究81-88
• 1、PKH26檢測(cè)15B7單抗識(shí)別肝癌干細(xì)胞81
• 2、流式熒光檢測(cè)15B7~+細(xì)胞在sphere細(xì)胞中的富集81-82
• 3、雙色免疫熒光檢測(cè)15B7識(shí)別ESA~+的肝癌干細(xì)胞82-83
• 4、流式雙色細(xì)胞熒光檢測(cè)15B7和ESA雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例83
• 5、15B7~+細(xì)胞的自我更新能力檢測(cè)83-84
• 6、15B7~+細(xì)胞的侵襲能力分析84-85
• 7、15B7單抗抑制sphere細(xì)胞的增殖能力85-86
• 8、15B7單抗抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新能力86
• 9、15B7單抗抑制肝癌干細(xì)胞的侵襲能力86-88
• 三、討論88-91
• 四、小結(jié)91-93
• 參考文獻(xiàn)93-99
• 致謝99-100
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文100

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3 陳偉;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞集落培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 徐洪璋;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

5 劉丹丹;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2004年

6 傅斌;人前列腺干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2004年

7 黃宇婷;骨髓來(lái)源干細(xì)胞異位向子宮內(nèi)膜方向分化的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

8 李勇;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及BMP2在誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

9 才曉君;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2005年

10 李銀華;脂肪干細(xì)胞作為血友病A基因治療靶細(xì)胞可能性的研究[D];武漢大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：抗人肝癌干細(xì)胞功能性單抗的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：303519