本文關鍵詞：抗人肝癌干細胞功能性單抗的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其死亡率位居惡性腫瘤的第三位[1]。腫瘤治療失敗導致高死亡率的根本原因是轉移、耐藥和復發(fā)[2]。近年來的研究證明腫瘤干細胞在惡性腫瘤的轉移、復發(fā)及耐藥中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此,靶向腫瘤干細胞的治療新策略,有望降低腫瘤轉移、復發(fā)及耐藥,提高療效,降低死亡率。 本研究首先選擇轉移能力不同的2株肝癌細胞系Be17402-V3和HepG2,采用無血清懸浮成球培養(yǎng)(sphere培養(yǎng))具有自我更新能力的腫瘤干細胞。應用流式免疫熒光和細胞免疫熒光技術檢測了PKH26、ESA、CD44、CD133、CD117等12種干細胞標志物,結果發(fā)現(xiàn)在Be17402-V3肝癌細胞系中ESA+和CD44+兩種表型的細胞在sphere培養(yǎng)細胞中被明顯富集,表明他們可能是肝癌干細胞。在HepG2細胞中,只有CD117+細胞可能是肝癌干細胞。采用流式熒光分選技術從2株肝癌細胞系中分別分選ESA+、CD44+及CD117+細胞經(jīng)體外sphere培養(yǎng),侵襲能力和耐藥性測定以及裸鼠體內(nèi)致瘤性檢測等研究,發(fā)現(xiàn)ESA+細胞具有腫瘤干細胞自我更新能力、高侵襲性、高耐藥性和在裸鼠體內(nèi)高致瘤性的特征,是肝癌細胞系Be17402-V3中的肝癌干細胞,ESA是肝癌干細胞的標志物之一。用同樣的技術首次在細胞系HepG2中也證明CD117+細胞是肝癌干細胞,CD117是肝癌干細胞的標志物之一。至此,我們成功地建立了肝癌干細胞的體內(nèi)成瘤細胞模型,為研究抗人肝癌干細胞抗體奠定了重要基礎。 在成功建立肝癌干細胞的細胞模型及體內(nèi)成瘤模型的基礎上,我們對前期篩選獲得的抗人肝癌干細胞的2株單抗15D2和15B7進行了生物學特性及單抗靶向肝癌干細胞治療肝癌的體內(nèi)實驗研究。首先采用雙色免疫熒光及雙色流式熒光檢測的結果發(fā)現(xiàn),15D2單抗能與肝癌干細胞標志物ESA、PKH26共染,表明該抗體識別的是肝癌干細胞。流式分選獲得的15D2+細胞經(jīng)體外sphere培養(yǎng)、侵襲性、耐藥性及體內(nèi)致瘤性檢測分析,發(fā)現(xiàn)15D2+細胞與15D2細胞比較,具有高度自我更新、高耐藥性和裸鼠體內(nèi)高致瘤性的腫瘤干細胞特征,證明15D2單抗是抗肝癌干細胞的特異性單抗。體外功能研究結果顯示,15D2單抗能顯著抑制肝癌干細胞的增殖和遷移侵襲功能.抑制率分別達41.7%、35%和11.9%,表明15D2單抗是抗人肝癌干細胞的功能性抗體。15D2單抗靶向肝癌干細胞治療肝癌的動物體內(nèi)實驗研究結果顯示,接種腫瘤細胞2個月,停藥1個月時,高、中、低劑量的15D2單抗治療組抑制肝癌生長的抑制率分別為82.6%、71.4%和60%,單抗高劑量聯(lián)合化療藥順鉑治療的抑制率為91%,但單用化療藥順鉑的抑制率為56.7%,而且近3周單用化療組腫瘤生長加快,顯示腫瘤復發(fā),這些結果表明抗肝癌干細胞單抗高劑量聯(lián)合化療組治療效果顯著優(yōu)于單用化療藥,并略優(yōu)于單用抗體組,表明15D2單抗靶向肝癌干細胞,不僅能明顯抑制腫瘤生長,而且還能治療腫瘤的復發(fā)和耐藥,這些結果讓我們看到靶向腫瘤干細胞治療有望通過抑制腫瘤復發(fā)轉移,突破耐藥而減少死亡率延長生存期的希望。 采用同樣的技術路線和方法,我們也證明了抗人肝癌干細胞單抗15B7是抑制識別人肝癌干細胞的單抗,15B7+細胞具有肝癌干細胞的高度自我更新、高侵襲等腫瘤干細胞的特征。體外功能研究也證明,15B7單抗能顯著抑制肝癌干細胞的sphere增殖及成球生長,其抑制率分別達50.3%和32.4%抑制遷移侵襲的抑制率達7.8%,表明15B7單抗也是一株抗人肝癌干細胞的功能性單抗。
【關鍵詞】：肝癌細胞系 肝癌干細胞 抗人肝癌干細胞功能性單抗 抗體靶向治療
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 圖表索引7-10
• 英文~.略詞10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 文獻綜述15-23
• 前言23-26
• 材料與方法26-40
• 一、實驗材料26-32
• 1.細胞26
• 2.動物26-27
• 3.主要試劑27-30
• 3.1 抗體27-28
• 3.2 常用試劑及材料28-30
• 4.主要儀器與設備30
• 5.計算機分析軟件30-31
• 6.主要自配試劑及其配方31-32
• 二、實驗方法32-40
• 1.肝癌細胞的培養(yǎng)32
• 1.1 人肝癌細胞系Bel7402-V3的傳代與培養(yǎng)32
• 1.2 人肝癌細胞系HepG2的傳代與培養(yǎng)32
• 2.肝癌干細胞相關亞群的無血清懸浮培養(yǎng)(sphere培養(yǎng))32
• 3.雜交瘤細胞的培養(yǎng)32
• 4.PKH26染色32-33
• 5.流式細胞術分析或分選33
• 6.雙色流式熒光分析或分選33-34
• 7.細胞免疫熒光34
• 8.雙色細胞免疫熒光34
• 9.原位細胞免疫熒光34-35
• 10.免疫組織化學檢測35
• 11.肝癌干細胞體外生物學特征的分析35-37
• 11.1 自我更新能力檢測35
• 11.2 增殖能力檢測35-36
• 11.3 耐藥能力檢測36
• 11.4 侵襲能力檢測36-37
• 12.肝癌干細胞體內(nèi)致瘤能力的分析37
• 13.抗肝癌干細胞單抗對肝癌干細胞生物學功能影響的分析37-38
• 13.1 抑制自我更新能力的檢測37
• 13.2 抑制侵襲能力的檢測37-38
• 13.3 抑制遷移能力的檢測38
• 14.單抗靶向肝癌干細胞治療肝癌的體內(nèi)實驗研究38
• 15.疏水層析純化IgM抗體38-39
• 16.統(tǒng)計學分析39-40
• 第一部分 人肝癌干細胞的分離與鑒定40-65
• 一、前言40-42
• 二、實驗結果42-61
• (一) 人肝癌細胞系Bel7402-V3中腫瘤干細胞的分離與鑒定42-54
• 1、PKH26染色檢測肝癌干細胞42-43
• 2、流式熒光檢測sphere細胞中肝癌干細胞的相關標志物43
• 3、雙色流式熒光檢測ESA~+CD44~+細胞在sphere細胞中的富集43-44
• 4、ESA~+CD44~+細胞的自我更新能力分析44-46
• 5、ESA~+CD44~+細胞的侵襲能力分析46-47
• 6、ESA~+CD44~+細胞的體內(nèi)致瘤能力分析47-48
• 7、PKH26染色檢測球形生長的腫瘤干細胞ESA的表達48-49
• 8、ESA~+細胞的自我更新能力分析49-50
• 9、ESA~+細胞的耐藥能力分析50-52
• 10、ESA~+細胞的侵襲能力分析52-53
• 11、ESA~+細胞的致瘤能力分析53-54
• (二) 人肝癌細胞系HepG2腫瘤干細胞的分離鑒定54-61
• 1、sphere培養(yǎng)及PKH26染色檢測肝癌千細胞54
• 2、流式熒光檢測sphere細胞中肝癌干細胞的相關標志物54-55
• 3、細胞免疫熒光檢測CD117~+細胞在sphere細胞中的富集55-56
• 4、CD117~+細胞的自我更新能力的檢測分析56-57
• 5、CD117~+細胞體外增殖能力檢測57-58
• 6、CD117~+細胞的耐藥能力檢測58-59
• 7、CD117~+細胞在SCID小鼠體內(nèi)的成瘤能力分析59-61
• 三、討論61-64
• 四、小結64-65
• 第二部分 抗肝癌干細胞單抗的研究65-93
• 一、前言65-69
• 二、實驗結果69-88
• (一) 抗人肝癌干細胞單抗15D2的研究69-81
• 1、PKH26檢測15D2單抗識別肝癌干細胞69-70
• 2、流式熒光檢測15D2~+細胞在sphere細胞中的富集70
• 3、雙色免疫熒光檢測15D2識別ESA~+的肝癌干細胞70-71
• 4、雙色流式熒光檢測15D2和ESA雙陽性細胞的比例71-72
• 5、15D2~+細胞的自我更新能力檢測72-73
• 6、15D2~+細胞的耐藥性分析73-74
• 7、15D2~+細胞的致瘤能力分析74-75
• 8、15D2單克隆抗體的純化75
• 9、15D2單抗抑制肝癌干細胞增殖能力的比較75-76
• 10、15D2單抗抑制肝癌干細胞的侵襲能力76-77
• 11、15D2單抗抑制肝癌干細胞的遷移能力77-78
• 12、15D2單抗靶向肝癌干細胞治療肝癌的體內(nèi)實驗研究78-81
• (二) 抗人肝癌干細胞單抗15B7的研究81-88
• 1、PKH26檢測15B7單抗識別肝癌干細胞81
• 2、流式熒光檢測15B7~+細胞在sphere細胞中的富集81-82
• 3、雙色免疫熒光檢測15B7識別ESA~+的肝癌干細胞82-83
• 4、流式雙色細胞熒光檢測15B7和ESA雙陽性細胞的比例83
• 5、15B7~+細胞的自我更新能力檢測83-84
• 6、15B7~+細胞的侵襲能力分析84-85
• 7、15B7單抗抑制sphere細胞的增殖能力85-86
• 8、15B7單抗抑制肝癌干細胞的自我更新能力86
• 9、15B7單抗抑制肝癌干細胞的侵襲能力86-88
• 三、討論88-91
• 四、小結91-93
• 參考文獻93-99
• 致謝99-100
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文100

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