本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而呈現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康,已成為重要的致死性疾病,上世紀(jì)的發(fā)病率顯著增加。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究取得了巨大進(jìn)步,但是大多數(shù)腫瘤仍不能被治愈。基于腫瘤的發(fā)病機制復(fù)雜而使其有效治療舉步維艱�，F(xiàn)有的治療方法如化療或放療均具有明顯的毒／副作用,醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者正研究靶向治療,使其藥物僅殺死腫瘤細(xì)胞而不傷害健康細(xì)胞。惡性腫瘤的發(fā)生受環(huán)境因素和遺傳因素共同影響,環(huán)境因素指除遺傳因素之外的所有范圍,而不僅僅指環(huán)境污染。常見的致癌環(huán)境因素包括飲食和肥胖(30-35%)、吸煙(25-30%)、感染(15-20%)、輻射(10%)、精神緊張、缺乏鍛煉和環(huán)境污染物等。大多數(shù)腫瘤發(fā)生與環(huán)境因素相關(guān),其中部分環(huán)境因素是可由生活方式控制的。因此,其實癌癥是一種有希望通過日常調(diào)理、藥物和疫苗來預(yù)防的疾病。惡性腫瘤的發(fā)生實際上是細(xì)胞分裂和生長失控,并侵入鄰近的身體部位而成癌。 在眾多影響腫瘤發(fā)生的因素中,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷及其對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的干擾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。活細(xì)胞中許多的氧化反應(yīng)需要酶催化,氧化反應(yīng)即分子間的氫質(zhì)子或電子轉(zhuǎn)移,這類代謝反應(yīng)是生命過程所需能量的主要來源。地球上絕大多數(shù)復(fù)雜的生命體都依賴氧而生存,但是氧是一種高活性分子,生物體會分解氧氣產(chǎn)生包括過氧化氫(H2O2)、次氯酸(HOC1)和自由基如羥基自由基(·OH)、超氧陰離子(02-)以及脂質(zhì)過氧化物等活性氧簇(reactive oxygen species, ROS),這些代謝產(chǎn)物可以直接或間接地對核酸、脂類和蛋白質(zhì)造成暫時或永久性損傷,從而對生物體自身造成損害。氧化-抗氧化狀態(tài)之間的不平衡造成的氧化損傷與眾多疾病的發(fā)生相關(guān),包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、急性呼吸窘迫綜合癥、慢性阻塞性肺疾病和哮喘等�；谧陨肀Ｗo,機體需要多種類型的抗氧化劑以維持氧化代謝的平衡。如谷胱甘肽、維生素C、維生素E以及一些酶類,包括過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等�？寡趸缚杀Ｗo細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷,抗氧化酶活性和表達(dá)的失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)DNA損傷并影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。ROS以多種形式損傷DNA,包括堿基修飾、自由基損害(嘌呤和嘧啶)、DNA斷裂及DNA-蛋白質(zhì)交互連接等。氧化應(yīng)激對腫瘤發(fā)生與治療的影響被越來越受到重視。有研究報道,前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤和其他多種腫瘤都伴有抗氧化酶活性降低或其表達(dá)下調(diào)；也有研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤中抗氧化酶水平無變化,或部分抗氧化酶的表達(dá)水平甚至升高。近期研究表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清中SOD、GPX、 CAT、維生素C和維生素E水平均顯著降低；非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者紅細(xì)胞裂解液中的SOD活性較低而GPX活性升高；前列腺癌患者的GPX、CAT和Cu/Zn-SOD活性均降低；口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者的SOD和CAT水平均降低;急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者全血中CAT和SOD活性降低；膀胱癌組織中CAT和SOD活性均顯著低于正常膀胱組織；肺腫瘤組織中總SOD活性升高,CAT活性下降；肺部炎癥會產(chǎn)生高水平Mn-SOD,但CAT水平降低,二者共同作用可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的H202水平上升,因此肺炎將會為DNA損傷和細(xì)胞惡變提供有利條件,在對肺癌組織和肺癌A549細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)SOD的水平增加、CAT水平降低、而GPX水平則無改變。 惡性腫瘤是一種典型的多因素疾病,遺傳因素與環(huán)境因素對腫瘤發(fā)生的影響相互相存。DNA變異可能引起原癌基因活化或抑瘤基因失活,從而使細(xì)胞分化、凋亡失控。基因突變可能是自發(fā)突變或者是暴露于輻射或致癌物質(zhì)所致。抗氧化酶可防止DNA的氧化損傷和延緩或改變細(xì)胞周期。某些病毒如人類T淋巴細(xì)胞病毒及某些化學(xué)物質(zhì),特別是含苯或烷基的藥物等均是重要的致癌因素。已觀察到在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中ROS的產(chǎn)生過量和／或抗氧化途徑障礙,已發(fā)現(xiàn)在一些類型的白血病中抗氧化酶活性缺陷或表達(dá)異常。因此,保持一定水平的抗氧化酶活性對于預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是至關(guān)重要的。另一方面,靶向抗氧化酶活性可作為腫瘤藥物治療的重要發(fā)展策略,研究發(fā)現(xiàn),單獨采用GPX和Mn-SOD基因療法可以分別減緩腫瘤生長速率達(dá)51%和54%,GPX和Mn-SOD基因共轉(zhuǎn)染則可達(dá)到81%的腫瘤細(xì)胞生長抑制率。此外,研究抗癌藥物對抗氧化酶活性和表達(dá)水平的影響將加速藥物的作用機制研究。 白藜蘆醇(resveratrol, RSV)是一種由植物產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)(stilbenoid),化學(xué)名稱為3,5,4’-三羥基-反式-二苯乙烯(見下圖),具有可利用的生物學(xué)活性。RSV主要存在于紅葡萄皮、豌豆、堅果、藍(lán)莓、桑椹、蔓越莓、姜黃、菠菜、百合等植物組織中,白藜蘆醇苷是RSV的前體,屬于二苯乙烯類化合物,是葡萄汁中主要的RSV前體物質(zhì)；白藜蘆醇苷經(jīng)米曲霉催化可以形成RSV。事實上,白藜蘆醇苷是自然界中最豐富的RSV儲存形式。植物中RSV的合成或轉(zhuǎn)化可通過應(yīng)激因素調(diào)節(jié),如真菌污染或紫外線輻射。植物中的RSV可作為一種植物抗毒素,能抑制某些植物傳染病的發(fā)生與發(fā)展。 研究表明,RSV能顯著增加抗氧化酶SOD、CAT、GPX等和非酶類抗氧化物質(zhì)如還原型谷胱甘肽、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等的抗氧化作用,并降低脂質(zhì)過氧化水平。RSV具有抗衰老、抗腫瘤活性,能夠延緩衰老過程并最大限度地減少與老化相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生；此外,RSV還具有保護心臟、抗糖尿病、抗炎癥、抗病毒及保護神經(jīng)系統(tǒng)等多種作用。已在腫瘤細(xì)胞株、動物模型甚至臨床研究中發(fā)現(xiàn)RSV能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；并在體內(nèi)和體外研究中證實RSV對皮膚癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、大腸癌、胰腺癌等具有治療或輔助治療效應(yīng)。機制研究表明,RSV可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期、抑制血管生成、抑制核因子-κB和環(huán)氧合酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、抑制致癌物的代謝活化、改變與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA表達(dá)模式及抗氧化等而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移或凋亡(見下圖)。近期研究表明,RSV可通過干擾pAktl/p70S6K信號途徑而抑制人類鼻咽癌(NPC)細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。但目前對RSV發(fā)揮作用的確切機制尚未完全了解。本研究即以腫瘤細(xì)胞株為試驗?zāi)Ｐ?研究RSV經(jīng)抗氧化而抑制腫瘤細(xì)胞生長的分子機制。 本研究采用3種不同的腫瘤細(xì)胞株,即前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞�，F(xiàn)今,這三種腫瘤都被認(rèn)為是最危險的危及生命的疾病。在全球男性癌癥死亡排名六大癌癥中,前列腺癌排名第二；乳腺癌是女性最常見的浸潤性腫瘤；肝癌則是全球最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率僅次于肺癌。人類前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞對于研究中晚期前列腺癌細(xì)胞的生化變化以及評價其對化療藥物的反應(yīng)性很有幫助,PC-3細(xì)胞株是雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞,建株于1979年,是從一名62歲的白人男性IV級前列腺癌骨轉(zhuǎn)移樣品中分離得到的；乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞是于1970年從一名69歲的白人女性患者組織樣品中分離得到的,是最常用于研究腫瘤發(fā)生機制的乳腺癌細(xì)胞；人類肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞來自于一名15歲美國白人男孩的高分化肝癌組織,HepG2細(xì)胞常用于研究肝癌的發(fā)生發(fā)展與治療機理。為了比較RSV對這些腫瘤細(xì)胞的作用及其機制,本研究中我們采用人胚腎細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞作為對照。本研究同時采用了幾株人類白血病細(xì)胞。人類早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞來自于美國一位患急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)的36歲女性,是研究髓樣分化的分子事件的人源細(xì)胞,APL是一種特殊類型的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML), HL-60細(xì)胞已成為研究AML的良好模型；K-562細(xì)胞是建株的第一個具有無限增殖特性的人類白血病細(xì)胞系,主要用作研究慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)的發(fā)生與治療機理,K-562細(xì)胞具有特征性的基于bcr/abl融合基因的費城染色體；KT-1/A3和KT-1/A3R細(xì)胞株是本研究采用的另外兩類CML細(xì)胞,其中KT-1/A3細(xì)胞呈現(xiàn)對干擾素的抗癌效應(yīng)敏感,而KT-1/A3R細(xì)胞則呈現(xiàn)干擾素抗性。 研究表明,RSV主要呈現(xiàn)抗氧化效應(yīng)。但是,為什么在一定條件下RSV能保護正常細(xì)胞而對腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞毒性仍然是一個有爭議的問題。此外,RSV在不同腫瘤中對抗氧化酶的表達(dá)和活性的影響效果仍然有一些不一致的結(jié)果�；诖�,本研究采用非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞作為對照,針對RSV對部分實體瘤及白血病細(xì)胞的作用,揭示RSV對腫瘤細(xì)胞的抗氧化酶表達(dá)水平及其活性的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而探討RSV的抗氧化活性對腫瘤細(xì)胞增殖／凋亡的影響,剖析RSV的抗氧化／抗腫瘤機制。 研究方法：采用不同濃度的RSV處理前列腺癌PC-3細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、CML細(xì)胞株(K-562、KT-1/A3、KT-1/A3R)、AML細(xì)胞株HL-60細(xì)胞和非腫瘤人胚腎細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞24-72小時,臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞生長狀態(tài),分光光度法檢測抗氧化酶的活性和過氧化氫(H2O2)的產(chǎn)量,Western印跡定量檢測抗氧化酶的表達(dá)水平,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布和凋亡率。 采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞,采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞、白血病細(xì)胞和非腫瘤HEK293T細(xì)胞,均加入10%的胎牛血清于37℃和5%濃度的CO2條件下培養(yǎng)。 以1.0×105/m1細(xì)胞接種于含有l(wèi)ml完全培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中,其培養(yǎng)基含有不同濃度(0、10、25、50和100μ M)的RSV；培養(yǎng)24、48和72小時后,富集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。 用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞的生長狀態(tài),貼壁生長細(xì)胞用胰蛋白酶處理,使之與培養(yǎng)皿分離,取等體積的懸浮生長細(xì)胞培養(yǎng)物或經(jīng)胰蛋白酶處理的貼壁生長細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)溶液混合,顯微鏡下計數(shù)未被染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)目。 以1000g、5分鐘離心富集培養(yǎng)細(xì)胞,棄上清后用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline, PBS)洗滌離心細(xì)胞,然后用200μl放射免疫沉淀分析緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA)和1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)處理細(xì)胞,冰浴30分鐘。將該溶液于12000g離心15分鐘,收集上清蛋白質(zhì)溶液,貯于-20℃?zhèn)溆谩?采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度,按體積比1：1將蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍(lán)溶液混合,室溫靜置5分鐘后,以牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,于595nm處測定待測蛋白質(zhì)溶液的吸光度并計算其蛋白質(zhì)濃度。 采用非連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)分離蛋白質(zhì)。首先,制備10%的分離膠,取dH2O7.78ml、40%Acr:Bis4. Oml、 pH8.8#的1.5M Tris-HCl4.0ml、10%SDS160μ1、10%APS80μ1和TEMED4.0μ1混合均勻,倒入PAGE玻璃槽；將膠在室溫下靜置1小時后,制備4%的濃縮膠含dH2O3.3ml、40%Acr:Bis0.96ml、0.5M Tris-HCl (pH6.8)2.0ml,10%SDS80μ1、10%APS40μ1和TEMED4.0μl,并倒入玻璃槽中覆蓋分離膠,將梳板插入凝膠中：成膠后,用16μl蛋白質(zhì)溶液與4μl上樣緩沖液混合,95℃加熱10分鐘后上樣；同樣點上已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物,60V電泳30分鐘后,于80-85V電泳90分鐘。 將凝膠上分離的蛋白質(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后將印跡膜于室溫浸泡在含5%脫脂牛奶的Tris緩沖生理鹽水和吐溫20(Tris-buffered saline and Tween20, TBST)緩沖液中2小時。印跡膜與第一抗體孵育12小時后用TBST潤洗。然后將印跡膜與辣根過氧化物酶(HRP)第二抗體輕輕震蕩孵育2小時,然后用TBST洗滌三次�；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)后,在暗室暴光于X-光片,使用凝膠成像系統(tǒng)("ImageJ"軟件)對Western印跡條帶進(jìn)行高密度數(shù)字化處理,對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。 以12000g離心5分鐘收集細(xì)胞,用PBS潤洗細(xì)胞,用含有1mM EDTA的PBS(pH7.0)勻漿,于40C、以12000g離心5分鐘后收集細(xì)胞上清液測定過氧化氫的含量和酶活性(U/mg蛋白質(zhì))；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；采用鉬酸銨法測定CAT活性；利用DTNB法測定GPX活性。 經(jīng)RSV誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時后,12000g離心5分鐘收集細(xì)胞,用PBS (pH7.4)洗滌并于70%乙醇中固定過夜。然后用流式細(xì)胞儀(北京鼎國昌盛生物有限公司)分別分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的百分比。 對以上實驗獲取的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析和比較檢驗,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P≤0.05顯示其統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果：本研究結(jié)果顯示,在濃度小于50μM的RSV處理24小時后,細(xì)胞生長狀態(tài)均無明顯改變；但是,25μM RSV處理48小時顯示PC-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長明顯受到抑制,但MCF-7細(xì)胞生長未受抑制；用10μM或者25μM的RSV處理72小時,PC-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長明顯受到抑制,但濃度低于25μ M的RSV對MCF-7細(xì)胞生長無抑制效應(yīng)：50μM的RSV處理48小時或72小時對三種細(xì)胞的生長都有明顯的抑制作用,同時也抑制非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞的生長；100μM的RSV對每種細(xì)胞株的生長都有明顯的抑制作用。25μM的RSV能抑制實驗中所用腫瘤細(xì)胞的生長而不影響非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞的生長,本研究選擇25μM的RSV作為最佳實驗用劑量。 對照組PC-3細(xì)胞中的SOD活性為4.94U/mg蛋白質(zhì),分別用10μM,25μM和50u M的RSV處理PC-3細(xì)胞72小時,其SOD活性分別增加43%、88%和105%；對照組HepG2細(xì)胞中SOD活性為3.41U/mg蛋白質(zhì),分別用10μM.25μM和50μM的RSV處理72小時,其SOD活性分別增加55%、63%和87%；對照組MCF-7細(xì)胞的SOD活性為2.82U/mg蛋白質(zhì),用濃度為25μ M和50μ M的RSV處理MCF-7細(xì)胞72小時,其SOD活性分別增加54%和60%；對照組HEK293T細(xì)胞中SOD的活性為4.8U/mg蛋白質(zhì),低濃度的RSV(10μM或25μM)對于其SOD活性沒有影響,但是50u M的RSV可使其活性增加49%。Western印跡分析顯示用濃度為25μ M的RSV處理細(xì)胞72小時,PC-3、HepG2和MCF-7細(xì)胞的SOD2表達(dá)量分別增加3倍、2.5倍和1.5倍,而對HEK293T細(xì)胞的作用則不明顯；細(xì)胞的處理組和非處理組中的SOD1表達(dá)水平無明顯差異。PC-3、HepG2、MCF-7和HEK293T細(xì)胞中的CAT活性分別為4.20、4.82、4.08和7.28U/mg蛋白質(zhì)。RSV處理72小時后各種細(xì)胞株的CAT活性都有一定程度的增加,25μM或50μ M的RSV處理HepG2細(xì)胞后其CAT活性分別增加了45%和42%；然而RSV處理對于其他細(xì)胞的CAT活性無明顯影響；Western印跡分析顯示用RSV處理的各種細(xì)胞株的CAT蛋白質(zhì)水平均無明顯改變。HEK293T、PC-3、HepG2和MCF-7細(xì)胞中的GPX活性分別為0.65、0.60、0.74和0.60U/mg蛋白質(zhì)；用10-50μM的RSV處理細(xì)胞72小時,GPX活性及GPX1蛋白質(zhì)水平均無明顯變化。 本研究結(jié)果顯示,RSV能明顯提高腫瘤細(xì)胞的H202產(chǎn)生量。用10μM的RSV處理腫瘤細(xì)胞72小時,其H202水平均略微增加,而用25μ M的RSV處理PC-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞72小時,其H202產(chǎn)生量均增加約2.5倍,經(jīng)同樣處理的MCF-7細(xì)胞的H202產(chǎn)生量略有增加。與此相反,經(jīng)10-25u M的RSV處理后,HEK293T細(xì)胞的H202產(chǎn)生量明顯降低。腫瘤細(xì)胞的過氧化氫產(chǎn)生量與其SOD活性呈正相關(guān)。 流式細(xì)胞分析表明,未經(jīng)RSV處理的PC-3細(xì)胞的凋亡率為4.40%,而經(jīng)RSV處理后,PC-3細(xì)胞的凋亡率提高了近7倍達(dá)29.11%；在未經(jīng)RSV處理的PC-3細(xì)胞培養(yǎng)液中,有50.72%的細(xì)胞處于G1期、39.71%的細(xì)胞處于S期、約9%的細(xì)胞處于G2期；而經(jīng)RSV處理后,處于G1期、S期和G2期的PC-3細(xì)胞比例分別為41.33%、58.66%和0.01%。經(jīng)RSV處理的HepG2細(xì)胞的凋亡率(22.89%)比未處理的HepG2細(xì)胞的凋亡率(3.70%)提高近7倍；未經(jīng)RSV處理的HepG2細(xì)胞處于G1期、S期和G2期的細(xì)胞比例分別為53.5%、39.89%和6.61%；然而,經(jīng)RSV處理的HepG2細(xì)胞處于G1期、S期的細(xì)胞分別為50.52%和49.48%,無G2期細(xì)胞。然而,RSV對MCF-7細(xì)胞的凋亡率影響甚微；未經(jīng)RSV處理的MCF-7細(xì)胞中53.02%的細(xì)胞處于G1期、42.04%的細(xì)胞處于S期、4.94%的細(xì)胞處于G2期,而經(jīng)RSV處理的MCF-7細(xì)胞處于G1期、S期的細(xì)胞分別為53.73%和46.27%,無G2期細(xì)胞。25μ M的RSV處理HEK293T細(xì)胞72h小時后,細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布均無變化(未處理組的細(xì)胞凋亡率為14.48%,處理組的細(xì)胞凋亡率為14.54%)。 RSV對白血病細(xì)胞的生長抑制呈劑量依賴性,其中對HL-60細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)最明顯。用低于50μ M的RSV處理24小時后,HL-60細(xì)胞的生長狀態(tài)無明顯改變,但是25μM的RSV處理HL-60細(xì)胞48小時則明顯抑制其生長；50μM的RSV處理K-562細(xì)胞72小時可抑制其生長；100μM的RSV對于被檢測的各類白血病細(xì)胞都有明顯的生長抑制效應(yīng)。RSV對白血病細(xì)胞的部分抗氧化酶表達(dá)水平及其活性具有顯著影響。Western印跡分析顯示用25μM的RSV處理HL-60細(xì)胞72小時,其SOD2表達(dá)水平升高36%,RSV處理可使K-562細(xì)胞的SOD2表達(dá)水平增加15%。然而,25μ M的RSV對HL-60和K-562細(xì)胞的SOD1、 CAT和GPX1的表達(dá)水平均無明顯影響。未經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞的SOD活性為3.3U/mg蛋白質(zhì),25u M的RSV處理HL-60細(xì)胞72小時則顯著增加其SOD活性至4.1U/mg蛋白質(zhì)(增加24%)；25u M的RSV處理K-562細(xì)胞可使其SOD活性增加11%；RSV幾乎不改變HL-60細(xì)胞和K-562細(xì)胞的GPX活性。 流式細(xì)胞分析顯示,RSV可增加白血病細(xì)胞株HL-60和K-562細(xì)胞的凋亡率,并改變其細(xì)胞周期分布。未經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞的凋亡百分比為3.89%,25μM的RSV處理72小時使HL-60細(xì)胞的凋亡百分比提高5倍(19.76%)；未經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞中,有35%的細(xì)胞處于G1期、59.2%的細(xì)胞處于S期、5.7%的細(xì)胞處于G2期,而經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞處于G1期、S期和G2期的百分比分別為63.2%、36%和0.05%。RSV處理K-562細(xì)胞可使其凋亡率由4.85%升高至7.9%；未經(jīng)RSV處理的K-562細(xì)胞中,50.7%的細(xì)胞處于G1期、49%的細(xì)胞處于S期、不到1%的細(xì)胞處于G2期；而RSV處理的K-562細(xì)胞中,39%的細(xì)胞處于G1期、60%的細(xì)胞處于S期、不到1%的細(xì)胞處于G期(G1/G2)期。 RSV明顯影響HL-60細(xì)胞的H2O2產(chǎn)生量。用25μM或者更高濃度的RSV處理HL-60細(xì)胞明顯增加其H2O2的生成。綜合分析發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生H2O2依賴于其SOD活性,并與其細(xì)胞凋亡率相關(guān)。 以上研究結(jié)果表明,RSV對腫瘤細(xì)胞的生長抑制呈劑量依賴性。RSV在10μM和25μM時就對PC-3和HepG2細(xì)胞生長有抑制作用,但不抑制MCF-7細(xì)胞生長；50μM的RSV能顯著抑制MCF-7細(xì)胞生長,但同時也能抑制HEK293T細(xì)胞生長。所以25μM的RSV被確定為PC-3和HepG2細(xì)胞生長抑制的最有效劑量,且此濃度不影響非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞的生長。RSV能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞尤其是PC-3和HepG2細(xì)胞凋亡。RSV抑制白血病細(xì)胞生長呈現(xiàn)劑量依賴性,且對HL-60細(xì)胞的生長抑制效果強于對K-562、KT-1/A3的和KT-1A3R細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)。低濃度RSV可顯著增加PC-3、HepG2和MCF-7細(xì)胞的SOD活性；低濃度RSV幾乎不影響肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的CAT活性及GPX活性；RSV能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)SOD2,但不影響SOD1、CAT及GPX1的表達(dá)。低濃度RSV處理能使PC-3和HepG2細(xì)胞大量產(chǎn)生H：O2,高濃度RSV處理能使MCF-7和HEK293T細(xì)胞大量產(chǎn)生H2O2。 討論：細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)水平和活性比例失調(diào)可能使過氧化氫產(chǎn)生量增加,繼而誘導(dǎo)如HepG2和PC-3等腫瘤細(xì)胞凋亡。另一方面,RSV對非腫瘤細(xì)胞如本研究采用的HEK293T細(xì)胞的抗氧化酶表達(dá)水平和活性僅呈輕微的但成比例的上調(diào),這可能具有防止正常細(xì)胞惡變的作用；故認(rèn)為RSV可能經(jīng)上調(diào)抗氧化酶表達(dá)和活性,緩解氧化應(yīng)激狀態(tài),具有預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用。對白血病細(xì)胞的研究表明,低濃度的RSV即能抑制HL-60細(xì)胞生長,但RSV對CML細(xì)胞生長抑制、凋亡及抗氧化酶如SOD2活性的調(diào)節(jié)效應(yīng)不明顯；提示RSV可能通過上調(diào)SOD2表達(dá)水平和活性而使線粒體H2O2產(chǎn)生量增加,繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,故此認(rèn)為,RSV具有治療AML的潛能。進(jìn)一步需深入研究RSV上調(diào)腫瘤細(xì)胞中抗氧化酶表達(dá)水平和活性的分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,以加速RSV的臨床應(yīng)用研究進(jìn)程。 抗氧化酶表達(dá)水平的下降或者活性降低可能是細(xì)胞癌變的重要機制之一。因此,上調(diào)抗氧化酶表達(dá)水平或者提高其酶活性可作為預(yù)防和治療惡性腫瘤的重要策略。研究發(fā)現(xiàn)孕激素能上調(diào)過氧化氫酶表達(dá)和活性,從而能夠有效預(yù)防乳腺癌；染料木素作為一種抗癌異黃酮,能夠上調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145的SOD2和過氧化氫酶的表達(dá)水平；�；撬峥山�(jīng)增加SOD、GPX和CAT表達(dá)水平而有效抑制B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長。動物實驗發(fā)現(xiàn)RSV具有抗腫瘤、抗炎癥、降血糖和保護心血管的作用,主要生物學(xué)效應(yīng)是抗氧化,并能猝滅ROS,避免其對細(xì)胞的氧化損傷,其抗氧化機制類似于維生素E。所以,RSV的抗氧化活性能保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn),葡萄中的RSV能作為減少免疫紊亂狀態(tài)下的氧化損傷和預(yù)防慢性退行性疾病的有效膳食補充劑。RSV對抗氧化損傷的高效保護機制表明RSV的抗氧化活性是預(yù)防腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)(見下圖)。 白藜蘆醇的抗氧化作用及其機制 白藜蘆醇使腫瘤細(xì)胞中SOD、CAT和GPX表達(dá)水平及其活性失衡,使線粒體中H202不斷積累并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;非惡變細(xì)胞中,白藜蘆醇平衡調(diào)節(jié)其抗氧化酶表達(dá)和活性,使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。 研究結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn),抗氧化酶表達(dá)失衡或其酶活性降低是實體瘤及白血病發(fā)生的重要病因之一；腫瘤細(xì)胞耐藥也常伴有抗氧化酶活性降低。故認(rèn)為,抗氧化酶表達(dá)上調(diào)或其活性增加是預(yù)防和治療惡性腫瘤的新策略。
【關(guān)鍵詞】：白藜蘆醇 腫瘤細(xì)胞株 抗氧化酶 過氧化氫 細(xì)胞生長 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要5-14
• Abstract14-17
• 目錄17-20
• Chapter 1: Introduction20-27
• 1.1. Cancer20-21
• 1.2. Cancer and antioxidant enzymes21-22
• 1.3. Resveratrol, and its orle in cancer prevention and therapy22-23
• 1.4. Cancer cell lines，，as in vitro study model23-26
• 1.5. Aims26-27
• Chapter 2: Materials and Methods27-33
• 2.1. Materials27-29
• 2.2. Experimental designs29-32
• 2.3. Statistical analysis32-33
• Chapter 3: Results33-53
• 3.1. Resveratrol inhibits tumor cell growtb in a dose and time-dependeiit manner33-36
• 3.2 Resveratrolrmediaetd iqp-iegulation of the activities and esqpression of antioxidantenzymes is disproportional ia tumor cells36-40
• 3.3. Resveratrol induces hydrogen peroxide production in tumor cells40-41
• 3.4. Resveratrol induces tumor cell aqoptosis41-44
• 3.5. Resveratrol induces growth inhibition in leukemic cells44-47
• 3.6. Resveratrol up-iegulates siq>at>xide dismutase (S0D2) in HL-60 cells47-50
• 3.7. Resveratrol induces hydrogen peroxide production in leukemic cells50-51
• 3.8. Resveartfol induces HL-60 cell qiopotsis51-53
• Chapter 4: Discussion53-59
• Chapter 5: Conclusions59-60
• References60-69
• Review69-85
• References78-85
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成績85-88
• 致謝88

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 晏芳;田雪梅;馬曉冬;;白藜蘆醇抑制HepG2細(xì)胞生長和對細(xì)胞間隙連接通訊的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年07期

  本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而呈現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：269225