本文關(guān)鍵詞：多靶點(diǎn)抗腫瘤天然活性成分篩選及其抑瘤活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本論文重點(diǎn)圍繞多靶點(diǎn)抗腫瘤天然活性成分的篩選及抗腫瘤機(jī)制開展研究,構(gòu)建EGFR、TNFR, Fas多靶點(diǎn)脂筏色譜模型,提取北葶藶子中具有抗腫瘤活性的部位。研究抗腫瘤活性部位體外抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞株增殖、促進(jìn)凋亡、調(diào)控周期及抑制遷移的機(jī)理。分析北葶藶子抗腫瘤活性部位體內(nèi)的急性毒性,同時(shí)探討其體內(nèi)抑制乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生長的機(jī)理。主要分為以下五個(gè)部分： 第一章多靶點(diǎn)脂筏親和色譜概述及中藥抗腫瘤概述 對(duì)脂筏親和色譜的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,充分調(diào)研了脂筏親和色譜的研究現(xiàn)狀,闡述了多靶點(diǎn)脂筏親和色譜的構(gòu)建原理；分別基于中醫(yī)傳統(tǒng)理論及現(xiàn)代分子生物學(xué)角度對(duì)中藥抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了綜述。同時(shí),闡述了本文研究對(duì)象,即北葶藶子的研究現(xiàn)狀,提出了本論文的研究目的、研究展望及實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì),為論文實(shí)驗(yàn)工作的順利進(jìn)行奠定了理論基礎(chǔ)。 第二章多靶點(diǎn)脂筏色譜的構(gòu)建及北葶藶子抗腫瘤活性部位的篩選 構(gòu)建了富含表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)和凋亡相關(guān)蛋白因子(Fas)的新型多靶點(diǎn)脂筏色譜,為實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、快速、在線篩選中藥抗腫瘤活性成分奠定了基礎(chǔ)。將多靶點(diǎn)脂筏色譜技術(shù)應(yīng)用于北葶藶子各部位抗腫瘤活性的篩選,采用MTT法對(duì)北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位進(jìn)行抗腫瘤活性研究。 從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株提取富含EGFR、TNFR、Fas的脂筏,制備硅膠固定相并與脂筏連接,構(gòu)建多靶點(diǎn)脂筏色譜。制備CdTe量子點(diǎn)并與EGFR、TNFR和Fas一抗偶聯(lián)后對(duì)脂筏色譜進(jìn)行鑒定。采用多靶點(diǎn)脂筏色譜篩選北葶藶子的水提液、乙醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水飽和正丁醇萃取部位及萃余部分的抗腫瘤活性部位。該活性部位以0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL分別作用于人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人肝癌細(xì)胞株HepG-2、人胃癌細(xì)胞株SGC和小細(xì)胞肺癌SCLC細(xì)胞株,72h后MTT法檢測(cè)其對(duì)四種腫瘤細(xì)胞生長的作用。此外,該活性部位及5-Fu分別以濃度1μg/mL、5μg/mL、101μg/mL、251μg/mL、50μg/mL作用于大鼠成纖維細(xì)胞,MTT法考察該活性部位及5-Fu對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明：北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位7.02-18.66min在多靶點(diǎn)脂筏色譜柱上有保留行為,表明該部位具有抗腫瘤活性。MTT法檢測(cè)水飽和正丁醇萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制效果(IC50為0.77μg/mL)優(yōu)于HepG2(IC50為1.55μg/mL)、SGC(IC50為5.49μg/mL)和SCLC(IC50為6.09μg/mL)細(xì)胞株。水飽和正丁醇萃取部位對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞的毒性較小。 第三章北葶藶子活性部位抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株機(jī)制的研究 從抑制增殖、促進(jìn)凋亡、調(diào)控周期、抑制遷移四個(gè)方面對(duì)北葶藶子活性部位的體外抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究。Western blot及免疫熒光法檢測(cè)了增殖相關(guān)的ERK磷酸化活性、凋亡相關(guān)的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白PCNA的表達(dá)；采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡和周期進(jìn)行了分析；采用DNA Ladder(?)口transwell技術(shù)研究了MCF-7細(xì)胞株的凋亡及其遷移。 Western blot及免疫熒光法檢測(cè)了北葶藶子活性部位對(duì)ERK磷酸化活性的作用,結(jié)果表明：其明顯抑制了ERK磷酸化的活性,且隨濃度的增加,抑制作用明顯增強(qiáng)。由此推測(cè),北葶藶子活性部位對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制增殖作用是通過抑制ERK介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。 通過Western blot檢測(cè)了北葶藶子活性部位對(duì)Bcl-2和Bax蛋白的作用,結(jié)果表明：北葶藶子活性部位作用于MCF-7細(xì)胞株24h后,對(duì)Bcl-2表達(dá)的抑制作用和對(duì)Bax表達(dá)的促進(jìn)作用均呈現(xiàn)出劑量依賴性,說明其在24h時(shí)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞株凋亡是通過調(diào)控Bcl-2家族的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。AnnexinV/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡發(fā)現(xiàn),北葶藶子活性部位可以明顯增加MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡,且具有時(shí)間劑量依賴關(guān)系。DNA Ladder研究北葶藶子活性部位及5-Fu對(duì)MCF-7細(xì)胞株凋亡的作用,結(jié)果表明：活性部位及5-Fu作用72h后,低、中、高三個(gè)濃度均可看到明顯的梯形條帶。 流式細(xì)胞技術(shù)分析北葶藶子活性部位對(duì)MCF-7細(xì)胞株周期影響的結(jié)果顯示,空白對(duì)照組S期細(xì)胞所占比例較高,提示MCF-7細(xì)胞株DNA合成活躍,腫瘤增殖性強(qiáng)。北葶藶子活性部位高濃度使MCF-7細(xì)胞株G0/G1期細(xì)胞的比例明顯增加,而S期MCF-7細(xì)胞所占的比例明顯下降,且有劑量依賴關(guān)系,表明其將MCF-7細(xì)胞株阻滯于G0/G1期,造成了G1期細(xì)胞堆積阻滯。Western blot及免疫熒光法分析PCNA蛋白的表達(dá),北葶藶子活性部位的低濃度給藥組在不同時(shí)間點(diǎn)均對(duì)PCNA的表達(dá)無明顯抑制作用,而中、高濃度組則能明顯抑制PCNA的表達(dá),從而干擾MCF-7細(xì)胞S期DNA的合成,降低了S期細(xì)胞所占比例。 采用transwell法檢測(cè)了北葶藶子活性部位及5-Fu對(duì)MCF-7細(xì)胞株遷移的作用。結(jié)果表明：北葶藶子活性部位組及5-Fu組均能明顯抑制MCF-7細(xì)胞株的遷移,且均呈時(shí)間劑量依賴關(guān)系。相同濃度的北葶藶子活性部位組與5-Fu組兩者對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用無明顯差異。 第四章北葶藶子活性部位急性毒理學(xué)研究 采用急性毒性分類法、改良寇氏法評(píng)價(jià)北葶藶子活性部位經(jīng)口、經(jīng)腹腔急性毒性作用。計(jì)算了北葶藶子活性部位經(jīng)口／腹腔的LD50,為其裸鼠移植瘤抑制作用的研究提供了劑量依據(jù)；通過計(jì)算北葶藶子活性部位經(jīng)口／腹腔的臟器系數(shù),評(píng)價(jià)其急性毒性。 急性毒性分類法結(jié)果表明：北葶藶子活性部位按2000mg/kg的劑量對(duì)小鼠灌胃給藥的LD5o約為4000～5000mg/kg,為低毒物質(zhì)。改良寇氏法計(jì)算腹腔注射給藥的LD5o,結(jié)果顯示：小鼠腹腔注射給藥的LD5o為505.36mg/kg, LD50的95%平均可信限為590.32mg/kg～432.61mg/kg。北葶藶子活性部位腹腔注射劑量低于250mg/kg時(shí),無急性毒性,為低毒物質(zhì)。 第五章北葶藶子活性部位對(duì)裸鼠MCF-7移植瘤抑制作用的研究 構(gòu)建了人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型,對(duì)北葶藶子活性部位經(jīng)口、經(jīng)腹腔的體內(nèi)抑瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用Western blot檢測(cè)了Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá),對(duì)北葶藶子活性部位的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 裸鼠背部右側(cè)皮下接種MCF-7細(xì)胞株建立移植瘤模型,北葶藶子活性部位按100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg口服給藥；按25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg腹腔注射給藥；5-Fu腹腔注射給藥20mg/kg,治療4周。治療結(jié)束后剝離瘤塊,測(cè)量瘤塊體積并稱重。采用Western blot對(duì)Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：北葶藶子活性部位經(jīng)口服給藥、腹腔注射給藥及5-Fu對(duì)瘤塊體積和重量均有明顯抑制作用(P0.05)。Western blot檢測(cè)北葶藶子活性部位組及5-Fu組均明顯降低了Bcl-2蛋白的表達(dá),增加了Bax蛋白的表達(dá)(P0.05)。北葶藶子活性部位腹腔注射給藥組對(duì)Bcl-2的抑制作用有劑量依賴關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：多靶點(diǎn) 脂筏色譜 北葶藶子 MCF-7 抗腫瘤機(jī)制 急性毒性
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要7-11
• ABSTRACT11-19
• 英文縮寫索引19-20
• 第一章 多靶點(diǎn)脂筏親和色譜概述及中藥抗腫瘤概述20-38
• 1.1 乳腺癌研究現(xiàn)狀20-21
• 1.2 多靶點(diǎn)脂筏親和色譜概述21-30
• 1.2.1 中藥活性成分篩選的傳統(tǒng)方法21
• 1.2.2 細(xì)胞膜親和色譜篩選模式21-22
• 1.2.3 多靶點(diǎn)脂筏色譜篩選模式22-30
• 1.3 中藥抗腫瘤機(jī)制的概述30-35
• 1.3.1 中藥抗腫瘤機(jī)制的研究30-34
• 1.3.2 中藥葶藶子的研究現(xiàn)狀34-35
• 1.4 本論文的研究目的、研究展望及實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)35-38
• 1.4.1 研究目的35
• 1.4.2 研究展望35
• 1.4.3 本論文研究方案35-38
• 第二章 多靶點(diǎn)脂筏色譜的構(gòu)建及北葶藶子抗腫瘤活性部位的篩選38-56
• 2.1 材料和方法39-44
• 2.1.1 材料39-41
• 2.1.2 方法41-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-52
• 2.2.1 CdTe量子點(diǎn)熒光光譜的測(cè)定44-45
• 2.2.2 脂筏及其固定相的鑒定結(jié)果45-46
• 2.2.3 北葶藶子活性部位的篩選46-48
• 2.2.4 水飽和正丁醇萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用48-51
• 2.2.5 水飽和正丁醇萃取部位對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性作用51-52
• 2.3 討論52-56
• 第三章 北葶藶子活性部位抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株機(jī)制的研究56-74
• 3.1 材料和方法57-63
• 3.1.1 材料57-59
• 3.1.2 方法59-63
• 3.2 結(jié)果63-71
• 3.2.1 Western blot檢測(cè)ERK磷酸化、Bcl-2及Bax的表達(dá)63-65
• 3.2.2 免疫熒光檢測(cè)p-ERK、Bcl-2及Bax的表達(dá)65-66
• 3.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡66-68
• 3.2.4 DNA Ladder分析MCF-7細(xì)胞株的凋亡68
• 3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞株周期的變化68-69
• 3.2.6 Western blot檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)69-70
• 3.2.7 Transwell檢測(cè)MCF-7細(xì)胞株的遷移能力70-71
• 3.3 討論71-74
• 第四章 北葶藶子活性部位急性毒理學(xué)研究74-84
• 4.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)概述74-78
• 4.1.1 急性毒性分類法74-75
• 4.1.2 上下增減量法75-76
• 4.1.3 固定劑量法76-77
• 4.1.4 三種方法的比較77-78
• 4.1.5 改良寇氏法計(jì)算LD_(50)78
• 4.2 材料與方法78-80
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物78
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)78
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)方法78-80
• 4.2.3.1 樣品的制備78-79
• 4.2.3.2 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)79
• 4.2.3.3 腹腔注射給藥急性毒性試驗(yàn)79
• 4.2.3.4 寇氏法計(jì)算LD_(50)79-80
• 4.2.3.5 計(jì)算LD_(50)的95%平均可信限(CL)80
• 4.2.3.6 臟器系數(shù)計(jì)算80
• 4.2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析80
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果80-82
• 4.3.1 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)80-81
• 4.3.2 腹腔注射給藥急性毒性試驗(yàn)81-82
• 4.4 討論82-84
• 第五章 北葶藶子活性部位對(duì)裸鼠MCF-7移植瘤抑制作用的研究84-94
• 5.1 材料和方法84-88
• 5.1.1 材料84-86
• 5.1.1.1 細(xì)胞株及裸鼠84
• 5.1.1.2 主要試劑84-85
• 5.1.1.3 主要儀器85
• 5.1.1.4 主要溶液85-86
• 5.1.2 方法86-88
• 5.1.2.1 MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)86-87
• 5.1.2.2 裸鼠模型建立87
• 5.1.2.3 分組及藥物處理87
• 5.1.2.4 觀察指標(biāo)與取材87-88
• 5.1.2.5 組織蛋白的提取88
• 5.1.2.6 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)88
• 5.1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法88
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果88-92
• 5.2.1 MCF-7裸鼠移植瘤88-89
• 5.2.2 移植瘤的重量和體積89-91
• 5.2.3 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax的表達(dá)91-92
• 5.3 討論92-94
• 第六章 全文總結(jié)94-97
• 6.1 主要結(jié)論94-95
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)95-97
• 參考文獻(xiàn)97-115
• 致謝115-116
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章及專利116-117

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙海譽(yù);范妙璇;石晉麗;王愛芹;李軍林;;北葶藶子化學(xué)成分研究[J];中草藥;2010年01期

2 趙海譽(yù),王秀坤,陸景珊;北葶藶子中揮發(fā)油及脂肪油類成分的研究[J];中草藥;2005年06期

3 李連懷;張淑華;常廣敬;任榮波;高靜;;南葶藶子和北葶藶子的電鏡掃描與理化鑒別[J];河北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1989年03期

4 Q面

本文編號(hào)：268297