本文關(guān)鍵詞：茯苓皮三萜提取物化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由于環(huán)境污染加劇、營養(yǎng)失衡以及生活壓力加大等因素,腫瘤已經(jīng)成為影響和威脅人類健康的第二大常見疾病。從中藥中尋找抗腫瘤活性部位及有效單體化合物已成為開發(fā)抗癌新藥的途徑之一。茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw). Wolf的干燥菌核,含有羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物,這類化合物普遍具有抗腫瘤的生物活性。茯苓中羊毛甾烷三萜多為同分異構(gòu)體,并且含量非常低,因此,對這類成分進(jìn)行分離純化非常困難,這嚴(yán)重阻礙了其抗腫瘤活性的研究。實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn),在采收時(shí),由于用藥量不大,其外皮(茯苓皮)常被當(dāng)做廢棄料丟棄。研究表明,茯苓皮中羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物含量較高,約為其內(nèi)核(白茯苓)的十倍,同時(shí)三萜化合物的種類也比白茯苓豐富,這非常利于對這些化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。因此,從茯苓皮中分離制備羊毛甾烷三萜類成分并闡明其抗腫瘤藥效活性是一項(xiàng)非常有意義的研究。本文制備了茯苓皮羊毛甾烷三萜提取物,考察了茯苓皮三萜提取物的體內(nèi)、體外抑瘤活性；采用傳統(tǒng)柱色譜、高速逆流色譜、超臨界流體制備色譜技術(shù)對茯苓皮三萜提取物中化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化；在此基礎(chǔ)上,考察了三萜單體化合物的癌細(xì)胞毒活性,分析了構(gòu)效關(guān)系。主要研究內(nèi)容如下：1茯苓皮乙酸乙酯部位的定性與定量分析采用LC-MS對茯苓皮乙酸乙酯部位中羊毛甾烷三萜色譜峰進(jìn)行了鑒定,指認(rèn)出13個(gè)羊毛甾烷三萜化學(xué)成分；采用紫外可見分光光度法對茯苓皮乙酸乙酯提取物中總?cè)频暮窟M(jìn)行了測定,結(jié)果表明,茯苓皮乙酸乙酯提取物中羊毛甾烷三萜的總量大于50%。因此茯苓皮乙酸乙酯部位可作為羊毛甾烷三萜提取物用于進(jìn)一步的化學(xué)成分及藥理學(xué)活性研究。2茯苓皮三萜提取物抗腫瘤活性研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對茯苓中羊毛甾烷類三萜化學(xué)成分的藥理活性進(jìn)行了預(yù)測,結(jié)果表明,這些三萜與乳腺癌、宮頸癌、肺癌等多種腫瘤疾病相關(guān)。建立Lewis荷瘤小鼠模型,考察了茯苓皮三萜提取物體內(nèi)抗Lewis肺癌活性,結(jié)果表明茯苓皮三萜提取物在65 mg/kg、90 mg/kg劑量連續(xù)灌胃給藥15天,抑瘤率與模型對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),分別為41.27%和58.87%。采用堿溶酸沉法對茯苓皮三萜提取物進(jìn)行了初步分離,得到三萜提取物的兩個(gè)不同極性部位,進(jìn)一步對這兩個(gè)部位的體外抑瘤活性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,茯苓皮羊毛甾烷三萜提取物不同極性部位對腫瘤細(xì)胞均有抑制活性,并表現(xiàn)出構(gòu)效關(guān)系的傾向,為其單體化合物抗腫瘤活性構(gòu)效關(guān)系研究打下了基礎(chǔ)。3茯苓皮三萜提取物化學(xué)成分分離3.1傳統(tǒng)柱色譜法分離三萜類成分采用硅膠柱色譜對茯苓皮三萜提取物進(jìn)行初步分離后,采用ODS中壓制備和半制備高效液相色譜對每個(gè)組份反復(fù)純化,共得到26個(gè)三萜化合物。采用MS和NMR對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,分別為dehydrotrametenolic acid (1)、trametenolic acid (2)、dehydroeburicoic acid (3)、eburicoic acid (4)、pachymic acid (5)、3-O-acetyl-16α-hydroxytrametenolic acid (6)、poricoic acid AE(7)、dehydropachymic acid (8)、poricoic acid GE (9)、poricoic acid AM (10)、poricoic acid BE (11)、 poricoic acid GM (12)、3-O-acetyl-16α-hydroxydehydrotrametenolic acid (13)、(3β,16a)-3-acetyloxy-16-hydroxy-24-methylenelanosta-5,7 (9),11-tetraene-21-oic acid (14)、polyporenic acid C (15)、16α-hydroxyeburiconic acid (16)、3β,15α-dihydroxylanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid (17)、3β, 16a-dihydroxylanosta-7,9 (11),24-trien-21-oic acid (18)、dehydrosulphurenic acid (19)、16a-hydroxytrametenolic acid (20)、dehydrotumulosic acid (21)、 tumulosic acid (22)、poricoic acid A (23)、16α-hydroxy-3,4-secolanosta-4 (28),7,9 (11),24 (31),25 (27)-pentaene-3,21-dioic acid (24)、poricoic acid B (25)、poricoic acid G (26),其中17和19為首次從茯苓中分離得到,9、11、14和24為新化合物。3.2高速逆流色譜法分離茯苓皮三萜類成分建立了茯苓皮三萜提取物中羊毛甾烷類三萜的高速逆流色譜分離方法。首先采用pH-區(qū)帶精制逆流色譜對羊毛甾烷提取物中目標(biāo)化合物進(jìn)行了富集,溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3：7：5：5,v/v),上相加入10 mM的三氟乙酸為固定相,下相加入10 mM的氨水為流動(dòng)相。經(jīng)過pH區(qū)帶精制逆流色譜富集后,從1.0 g粗提物中得到200 mg目標(biāo)成分的混合物。進(jìn)一步采用常規(guī)高速逆流色譜對目標(biāo)成分混合物進(jìn)行分離,溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.8：1.2：1.2：0.9,v/v)。一次進(jìn)樣120 mg,可得到50 mg的poricoic acid A和5 mg的poricoic acid B,經(jīng)HPLC測定,其純度分別為95%和98%。3.3高速逆流色譜法分離白茯苓中三萜類成分建立了白茯苓中羊毛甾烷三萜化合物的高速逆流色譜分離方法。首先采用堿溶酸沉法對白茯苓乙醇提取物進(jìn)行了初步分離,可分為堿不溶解部位和酸沉淀部位。對這兩個(gè)部位分別采用高速逆流色譜進(jìn)行分離,共得到六個(gè)羊毛甾烷三萜類成分,這些化合物經(jīng)ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR鑒定為dehydropachymic acid、pachymic acid、3-epi-dehydropachymic acid、 poricoic acid B、dehydrotumulosic acid和3-epi-dehydrotumulosic acid,經(jīng)HPLC測定,其純度分別為94.1%、96.2%、93.5%、85.9%、80.1%和93.1%。3.4超臨界流體制備色譜分離茯苓皮中難以分離純化的三萜類成分茯苓乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜、反相C18中壓柱色譜法富集、初級分離后,采用超臨界流體制備色譜分離,以甲醇-C02(15%：85%)等度洗脫,得到三個(gè)羊毛甾烷類化合物�；衔锝�(jīng)ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR鑒定為polyporenic acid C、poricoic acid AM 和3-O-acetyl-16a-hydroxydehydrotrametenolic acid。經(jīng)HPLC分析,其純度分別為93%、80%和99%。與常規(guī)反相制備色譜相比,超臨界流體制備色譜在分離制備三萜類化合物上具有簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)。4茯苓皮三萜單體化合物體外抗腫瘤活性研究選取兩種取代基團(tuán)完全不同的羊毛甾烷三萜單體化合物(poricoic acidAM和3-O-acetyl-16a-hydroxytrametenolic acid),研究它們對8種腫瘤細(xì)胞的體外抑制活性,結(jié)果表明這兩個(gè)化合物對8種腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制活性,與上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)活性預(yù)測結(jié)果及體內(nèi)抑制Lewis肺癌的作用一致。在此基礎(chǔ)上,考察了24個(gè)羊毛甾烷三萜單體化合物體外對MGC-803和HepG2的細(xì)胞毒性,并對其細(xì)胞毒活性構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明,上述單體化合物具有不同程度的腫瘤細(xì)胞抑制活性,并且表現(xiàn)出了構(gòu)效關(guān)系,即16位或15位羥基、BC環(huán)上的雙鍵均可增強(qiáng)羊毛甾烷三萜對腫瘤細(xì)胞的毒性；3位羥基乙�；�,24(25)-烯型羊毛甾烷類三萜化合物對腫瘤細(xì)胞的毒性增強(qiáng),而24(31)-烯型羊毛甾烷三萜化合物對腫瘤細(xì)胞的毒性降低。綜上,本研究對茯苓中羊毛甾烷三萜單體化合物進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測,在此基礎(chǔ)上對茯苓皮三萜提取物對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤活性進(jìn)行了研究；體外抑瘤活性實(shí)驗(yàn)表明茯苓皮三萜提取物具有抑瘤活性。在明確了茯苓皮三萜提取具有抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用柱色譜法、高速逆流色譜法、超臨界流體色譜法對茯苓皮三萜提取物中化學(xué)成分進(jìn)行了分離,共得到26個(gè)羊毛甾烷三萜單體化合物,其中4個(gè)為新化合物,2個(gè)為首次從茯苓中分離得到。體外抑瘤活性研究結(jié)果表明,茯苓皮中羊毛甾烷三萜單體化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性表現(xiàn)出了構(gòu)效關(guān)系。以上研究為茯苓中羊毛甾烷三萜抗腫瘤活性及抗腫瘤藥物的的開發(fā)提供了參考價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：茯苓皮三萜提取物 抗腫瘤活性 羊毛甾烷三萜 成分分離 構(gòu)效關(guān)系
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R284;R285
【目錄】：

• 摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 英文縮略語16-17
• 前言17-19
• 第一章 天然產(chǎn)物中羊毛甾烷型四環(huán)三萜化合物研究進(jìn)展19-42
• 第一節(jié) 羊毛甾烷化合物分布及結(jié)構(gòu)類型19-21
• 第二節(jié) 羊毛甾烷類化合物藥理活性研究21-32
• 1 抗腫瘤作用21-29
• 2 抗炎作用29-30
• 3 抑制脂肪3T3-L1分化30
• 4 抗HIV活性30-31
• 5 其他生物活性31-32
• 第三節(jié) 小結(jié)32
• 參考文獻(xiàn)32-42
• 第二章 茯苓皮三萜提取物三萜類成分的定性定量分析42-50
• 第一節(jié) 茯苓皮三萜提取物的制備與三萜成分定性分析42-46
• 1 儀器與試劑42
• 2 茯苓皮三萜提取物的制備42-43
• 3 茯苓皮三萜提取物三萜類成分的定性分析43-46
• 第二節(jié) 茯苓皮三萜提取物三萜成分的定量分析46-48
• 1 儀器與試藥46
• 2 方法與結(jié)果46-48
• 第三節(jié) 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 第三章 茯苓皮三萜提取物抗腫瘤活性研究50-64
• 第一節(jié) 茯苓三萜類化合物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)活性預(yù)測50-54
• 1 材料與方法50-52
• 2 結(jié)果與討論52-54
• 3 小結(jié)54
• 第二節(jié) 茯苓皮三萜提取物體內(nèi)抗肺癌活性研究54-58
• 1 儀器與試藥54-55
• 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55
• 3 腫瘤細(xì)胞株55
• 4 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-57
• 6 結(jié)論57-58
• 第三節(jié) 茯苓皮三萜提取物體外細(xì)胞毒活性研究58-61
• 1 儀器、試劑與材料58
• 2 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 3 結(jié)果與結(jié)論59-61
• 第四節(jié) 小結(jié)61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 第四章 茯苓皮三萜提取物化學(xué)成分分離64-115
• 第一節(jié) 常規(guī)柱色譜法分離制備茯苓皮三萜提取物中三萜類化合物64-94
• 1 提取分離66-69
• 2 新化合物結(jié)構(gòu)解析69-81
• 3 化合物鑒定數(shù)據(jù)81-94
• 第二節(jié) 高速逆流色譜法分離茯苓皮中三萜類化合物94-99
• 1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)材料94
• 2 實(shí)驗(yàn)部分94-95
• 3 結(jié)果與討論95-99
• 第三節(jié) 高速逆流色譜分離白茯苓中三萜類化合物99-107
• 1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)材料66-94
• 2 實(shí)驗(yàn)部分94-95
• 3 結(jié)果與討論95-107
• 4 結(jié)論107
• 第四節(jié) 超臨界流體制備色譜分離制備茯苓皮中三萜類成分107-112
• 1 儀器與試劑107
• 2 實(shí)驗(yàn)方法107-110
• 3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定110-111
• 4 結(jié)論111-112
• 第五節(jié) 小結(jié)112
• 參考文獻(xiàn)112-115
• 第五章 茯苓皮三萜單體化合物體外抗腫瘤活性研究115-122
• 第一節(jié) 茯苓皮三萜單體化合物體外抗腫瘤活性研究115-117
• 1 儀器與試劑115
• 2 實(shí)驗(yàn)方法115-116
• 3 結(jié)果與討論116-117
• 第二節(jié) 茯苓皮三萜單體化合物抗腫瘤活性構(gòu)效關(guān)系研究117-121
• 1 儀器與試劑117
• 2 實(shí)驗(yàn)方法117-119
• 3 結(jié)果與討論119-121
• 參考文獻(xiàn)121-122
• 第六章 小結(jié)122-124
• 致謝124-125
• 作者簡介125-126
• 附圖126-143

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：茯苓皮三萜提取物化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：269292