本文關(guān)鍵詞：抗LunX和EpCAM抗體腫瘤生物治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：惡性腫瘤是當(dāng)今世界威脅人類健康和導(dǎo)致人類死亡的最嚴(yán)重疾病之一,如何有效治療惡性腫瘤已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來,隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞水平到分子水平的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子靶向治療在臨床上取得了顯著的療效。研究癌癥發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制,發(fā)現(xiàn)誘發(fā)癌變相關(guān)的特異性分子,再針對(duì)這些特異性的分子給予有力打擊,將會(huì)大大改善療效。單克隆抗體藥物憑其特異性高和毒性低已經(jīng)成為分子靶向治療研究的熱點(diǎn),臨床實(shí)踐表明單克隆抗體卓著的療效已經(jīng)把腫瘤的治療推向一個(gè)前所未有的新階段。 21世紀(jì)以來,抗體治療取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,已經(jīng)成為血液瘤和實(shí)體瘤治療最成功和最重要的策略之一。目前,抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制和策略包括：阻斷或激活腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或凋亡的信號(hào)傳導(dǎo),活化免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的腫瘤殺傷,偶聯(lián)功能效應(yīng)分子靶向殺傷腫瘤細(xì)胞,靶向血管形成或腫瘤基質(zhì)細(xì)胞。一個(gè)單克隆抗體進(jìn)入臨床,需對(duì)其物理和化學(xué)等相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行全面檢測(cè)和分析：具體地說,包括分析識(shí)別的抗原表達(dá)水平,發(fā)揮的免疫效應(yīng)功能和影響的信號(hào)通路,體內(nèi)的分布、活性以及半衰期等。但是,決定一個(gè)單克隆抗體是否能夠成為臨床藥物的關(guān)鍵是其療效和安全性。 一個(gè)單克隆抗體的療效和安全性主要取決于其識(shí)別的抗原靶點(diǎn),因此尋找合適的治療靶點(diǎn)成為抗體治療的主要挑戰(zhàn)和瓶頸。理想中的靶向抗原應(yīng)該是高特異性,高豐度、明確的結(jié)構(gòu)和功能信息等。 肺癌已經(jīng)成為實(shí)體瘤中發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一。到目前為止,還沒有發(fā)現(xiàn)肺癌特異的治療靶點(diǎn),因此急需尋找有效的肺癌治療靶點(diǎn),從而有利于肺癌的早期診斷以及靶向治療。肺特異X蛋白(LunX)屬于PLUNC家族,前期研究發(fā)現(xiàn)LunX mRNA可作為肺癌診斷的特異性生物標(biāo)志物,而LunX蛋白與肺癌的相關(guān)性仍未報(bào)道。那么LunX蛋白是否廣泛表達(dá)于肺癌組織；是否促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展；是否可作為肺癌生物治療的靶標(biāo)?于是圍繞上述三個(gè)問題開展靶向LunX治療肺癌的相關(guān)性研究。 血液瘤現(xiàn)如今已是兒童和青少年腫瘤的頭號(hào)殺手。上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)是公認(rèn)的惡性腫瘤相關(guān)抗原,過表達(dá)于肺癌,肝癌,胃癌等惡性實(shí)體瘤中,但在大部分正常人上皮細(xì)胞中也處于低表達(dá)狀態(tài)。EpCAM已成為多種實(shí)體瘤臨床免疫治療的靶點(diǎn)(Munz, Baeuerle et al.2009)。目前,EpCAM及其抗體的臨床應(yīng)用只局限于實(shí)體瘤,而其與白血病的相關(guān)性至今沒有通過大量臨床標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證；如果EpCAM過表達(dá)于白血病細(xì)胞,那么EpCAM可能也是白血病治療的新型靶點(diǎn),其抗體也可作為白血病治療的潛在治療藥物。 本文主要從尋找肺癌和血液瘤的治療靶點(diǎn)展開研究,獲得了如下結(jié)果： I、抗LunX抗體抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)及其轉(zhuǎn)移 本研究利用免疫組化技術(shù)分析150例肺癌病人的腫瘤組織和癌旁組織LunX蛋白表達(dá)水平；應(yīng)用卡普蘭-邁耶曲線分析其中108例病人術(shù)后生存周期和LunX表達(dá)量的相關(guān)性；為了研究LunX與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)83例肺癌病人新鮮引流淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)穿刺標(biāo)本和胸水標(biāo)本中侵襲腫瘤細(xì)胞LunX表達(dá)水平,以及通過LunX RNA干擾和過表達(dá)技術(shù),驗(yàn)證LunX與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究LunX參與的信號(hào)通路,利用免疫共沉淀和免疫印跡技術(shù)尋找LunX作用的靶蛋白以及調(diào)控的信號(hào)通路。最后研制LunX治療性抗體,通過體外抗體抑制試驗(yàn)以及體內(nèi)肺癌移植模型小鼠驗(yàn)證LunX抗體的功能。本研究通過上述研究方案取得了如下結(jié)果： 1.LunX表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌 檢測(cè)肺癌病人的腫瘤組織LunX蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)LunX過表達(dá)于肺癌組織并且陽性率達(dá)到90%,其中LunX蛋白表達(dá)越高的患者呈現(xiàn)更差的病理分期和更低的分化狀態(tài),并且還發(fā)現(xiàn)LunX表達(dá)水平越高的病人呈現(xiàn)更低的生存率。此外,在多種肺癌細(xì)胞系中都可以檢測(cè)到LunX的廣泛表達(dá)。另外,在正常外周肺組織以及乳腺、肝臟、卵巢等其他器官中沒有檢測(cè)到LunX的表達(dá)。 2. LunX高表達(dá)于轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞 肺局部淋巴結(jié)和鎖骨上淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞全呈LunX陽性,并且,LunX表達(dá)越高的病人,其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率也越高。此結(jié)果提示LunX與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。 3. LunX促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移 在不同LunX表達(dá)水平的肺癌細(xì)胞中,LunX表達(dá)水平高的肺癌細(xì)胞呈現(xiàn)更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。在A549和NCI-H292細(xì)胞中,干擾LunX能夠明顯抑制其增殖、遷移以及侵襲,過表達(dá)LunX,反之。 4. LunX通過活化14-3-3信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移 在肺癌細(xì)胞中,LunX直接作用于14-3-3蛋白,并且通過阻斷14-3-3的磷酸化促進(jìn)其形成活化狀態(tài)的同源或異源二聚體,進(jìn)而活化下游的Erkl/2和JNK信號(hào)通路,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。 5.靶向LunX小干擾RNA抑制肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 在人肺癌原位,皮下瘤以及轉(zhuǎn)移的小鼠模型中,靶向LunX能夠抑制原位腫瘤的生長(zhǎng),局部侵襲、遠(yuǎn)端克隆病灶形成以及遠(yuǎn)端腫瘤病灶的生長(zhǎng)；提示LunX可作為肺癌有效的治療靶點(diǎn)。 6. LunX抗體在體外能夠通過抗原抗體的內(nèi)吞和降解抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移 基于肺癌細(xì)胞過表達(dá)LunX, LunX蛋白存在于細(xì)胞膜表面以及LunX促進(jìn)肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,于是制備和篩選了LunX抗體(S-35-8),發(fā)現(xiàn)LunX抗體抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。LunX抗體的主要抗腫瘤機(jī)制是介導(dǎo)LunX蛋白的內(nèi)吞及降解,進(jìn)而抑制LunX下游信號(hào)通路。 7. LunX抗體在肺癌模型小鼠中抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移 LunX抗體能夠明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,并呈現(xiàn)劑量依賴性。LunX抗體處理正常小鼠沒有出現(xiàn)明顯的組織炎癥和病理性特征。因此,初步結(jié)果顯示該抗體在體內(nèi)毒性較小,為后續(xù)抗體的人源化和治療奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述,基于上述LunX蛋白的表達(dá)特異性和其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的致癌機(jī)理,以及LunX體內(nèi)沉默后的腫瘤抑制以及阻斷性抗體的治療作用,可初步確認(rèn)LunX作為肺癌治療的新靶標(biāo)。該研究中的人源化治療性抗體有可能對(duì)肺癌臨床治療具有重要意義。 Ⅱ、抗EpCAM抗體抑制髓系血液瘤的形成 本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各種類型血液瘤患者的骨髓和外周血標(biāo)本中EpCAM的表達(dá),以及患者化療前后EpCAM陽性細(xì)胞的比例的變化。另外還通過體內(nèi)外的克隆形成和成瘤實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證EpCAM是否參與血液瘤的形成。制備EpCAM治療性抗體,并驗(yàn)證其體內(nèi)抗腫瘤的效應(yīng)以及機(jī)制。獲得的結(jié)果如下：1.EpCAM表達(dá)于髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 在髓系細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤病人的骨髓標(biāo)本和外周血標(biāo)本中檢測(cè)到EpCAM的表達(dá),而在正常人的骨髓和外周血標(biāo)本中沒有檢測(cè)到EpCAM的表達(dá)。另外,髓系來源的白血病細(xì)胞系也呈EpCAM陽性。 2.EpCAM+|白血病細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療藥物耐藥性 在化療前后的同一病人標(biāo)本中,EpCAM+細(xì)胞占異常細(xì)胞的比例在化療后明顯升高,并且EpCAM-細(xì)胞比EpCAM+細(xì)胞對(duì)化療藥更敏感。提示EpCAM促進(jìn)白血病細(xì)胞的耐化療作用。 3. EpCAM抗體抑制白血病腫瘤病灶的形成 在K562和HL60皮下瘤模型中,EpCAM抗體能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng),當(dāng)抗體濃度遞增到80mg/kg(小鼠每千克體重)時(shí),腫瘤病灶能夠完全被清除。在尾靜脈接種的移植瘤小鼠模型中,EpCAM抗體治療能夠抑制腫瘤在頸部淋巴結(jié)和骨髓等部位的形成,并且外周血中的腫瘤細(xì)胞數(shù)也明顯減少。該模型中,抗體能明顯延長(zhǎng)小鼠的生存周期。 4. Macrophage介導(dǎo)抗抗EpCAM抗體的抗腫瘤作用 EpCAM抗體的治療促進(jìn)了脾臟F/80+Gr-1-的巨噬細(xì)胞向腫瘤局部的遷移和聚集,并介導(dǎo)抗腫瘤的過程。 綜上所述,基于上述EpCAM蛋白的表達(dá)特異性和其促進(jìn)腫瘤形成與耐藥性的致癌機(jī)理,以及EpCAM抗體的抗腫瘤作用,可初步確認(rèn)EpCAM可作為髓系白血病治療的新靶標(biāo)。該研究中的人源化治療性抗體有可能對(duì)髓系白血病臨床治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 LunX 抗體治療 腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 白血病 EpCAM 耐化療 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 符號(hào)說明13-14
• 目錄14-18
• 圖序18-20
• 第一章 緒論肺癌和白血病生物治療研究現(xiàn)狀20-42
• 1.1 肺癌研究現(xiàn)狀20-31
• 1.1.1 肺癌的分類20-21
• 1.1.2 肺癌的診斷21-22
• 1.1.3 肺癌的發(fā)生機(jī)制22-23
• 1.1.3.1 吸煙22
• 1.1.3.2 大氣污染22
• 1.1.3.3 肺部慢性炎癥22-23
• 1.1.4 肺癌相關(guān)基因的變化23-24
• 1.1.5 肺癌的常規(guī)治療24-25
• 1.1.5.1 手術(shù)24
• 1.1.5.2 放射治療24-25
• 1.1.5.3 化療25
• 1.1.6 個(gè)性化治療25-26
• 1.1.7 靶向治療26-31
• 1.1.7.0 EGFR26-28
• 1.1.7.1 VEGF28
• 1.1.7.2 ALK28
• 1.1.7.3 ROS128-29
• 1.1.7.4 RET29
• 1.1.7.5 MET29
• 1.1.7.6 FGFR129-30
• 1.1.7.7 PTEN30
• 1.1.7.8 P13K30
• 1.1.7.9 PD-1/PD-L130-31
• 1.1.7.10 CTLA-431
• 1.1.8 肺癌和LunX31
• 1.2 白血病31-42
• 1.2.1 白血病的分類32-33
• 1.2.2 白血病發(fā)病機(jī)制及治療33-38
• 1.2.2.1 急性淋巴細(xì)胞白血病33-36
• 1.2.2.2 急性髓系白血病36-37
• 1.2.2.3 慢性淋巴細(xì)胞白血病37-38
• 1.2.3 白血病干細(xì)胞38-42
• 1.2.3.1 白血病干細(xì)胞研究現(xiàn)狀38-39
• 1.2.3.2 白血病干細(xì)胞的表型39
• 1.2.3.3 白血病干細(xì)胞的靶向治療39-42
• 第二章 材料與方法42-58
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料42-48
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• 2.1.2 臨床標(biāo)本42
• 2.1.3 質(zhì)粒42
• 2.1.4 病毒42-43
• 2.1.5 細(xì)胞系及培養(yǎng)基43
• 2.1.6 抗體43-44
• 2.1.7 蛋白純化試劑44-45
• 2.1.8 ELISA試劑45
• 2.1.9 細(xì)胞遷移和侵襲試劑和耗材45
• 2.1.10 總RNA提取和RT-PCR相關(guān)試劑45
• 2.1.11 免疫熒光和免疫組化試劑45
• 2.1.12 引物45-46
• 2.1.13 核酸電泳相關(guān)試劑46-47
• 2.1.14 1xPBS(磷酸鹽緩沖液)47
• 2.1.15 蛋白表達(dá)及其變復(fù)性相關(guān)試劑47
• 2.1.16 細(xì)菌培養(yǎng)相關(guān)試劑47
• 2.1.17 SDS-PAGE和West blotting相關(guān)試劑47-48
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器48-49
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法49-58
• 2.3.1 LunX和EpCAM蛋白的表達(dá)和純化49-51
• 2.3.1.1 構(gòu)建LunX表達(dá)載體49
• 2.3.1.2 構(gòu)建EpCAM表達(dá)載體49-50
• 2.3.1.3 誘導(dǎo)LunX和EpCAM蛋白的表達(dá)及其純化50-51
• 2.3.2 LunX和EpCAM抗體的制備51
• 2.3.3 免疫熒光51-52
• 2.3.4 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)52
• 2.3.5 West blotting52-53
• 2.3.6 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)53
• 2.3.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)53
• 2.3.8 免疫共沉淀53
• 2.3.9 人源肺癌皮下移植小鼠模型53-54
• 2.3.10 人源白血病皮下移植小鼠模型54
• 2.3.11 人源肺癌尾靜脈注射小鼠模型54
• 2.3.12 人白血病尾靜脈注射小鼠模型54
• 2.3.13 人源肺癌原位小鼠模型54-55
• 2.3.14 小動(dòng)物成像55
• 2.3.15 RNA提取和RT-PCR55-56
• 2.3.16 ELISA檢測(cè)56-57
• 2.3.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析57-58
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ⅰ抗LunX抗體抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移58-86
• 3.1 引言58
• 3.2 LunX特異表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌58-62
• 3.3 LunX高表達(dá)于轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌62-64
• 3.4 LunX促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移64-67
• 3.5 LunX結(jié)合于14-3-3蛋白67-68
• 3.6 LunX通過活化14-3-3信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移68-72
• 3.7 LunX促進(jìn)肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移72-77
• 3.8 LunX抗體抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移77-80
• 3.9 LunX抗體抗腫瘤機(jī)制：抗體介導(dǎo)LunX蛋白的內(nèi)吞及降解80-82
• 3.10 LunX抗體抑制肺癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移82-85
• 3.11 小結(jié)85-86
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ⅱ 抗EpCAM抗體抑制髓系血液瘤的形成86-96
• 4.1 引言86
• 4.2 EpCAM表達(dá)于髓系白血病細(xì)胞86-89
• 4.3 EpCAM~+白血病細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療藥物耐藥性89-91
• 4.4 EpCAM促進(jìn)腫瘤形成91-92
• 4.5 抗EpCAM抗體抑制髓系白血病病灶的形成和生長(zhǎng)92-93
• 4.6 Macrophage介導(dǎo)抗EpCAM抗體的抗腫瘤作用93-96
• 參考文獻(xiàn)96-110
• 致謝110-112
• 攻讀博士學(xué)位期間的主要研究成果112-114
• 附錄114-117

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 洪衛(wèi);張沂平;;肺鱗癌驅(qū)動(dòng)基因研究進(jìn)展[J];中國(guó)肺癌雜志;2014年05期

2 Feras Al-Shahrabani;Daniel Vallb銉hmer;Sebastian Angenendt;Wolfram T Knoefel;;Surgical strategies in the therapy of non-small cell lung cancer[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年04期

  本文關(guān)鍵詞：抗LunX和EpCAM抗體腫瘤生物治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：254225