發(fā)布時間：2021-12-19 07:39

　　研究背景:遺傳性骨骼疾病是由于調(diào)控骨骼軟骨發(fā)育的基因發(fā)生突變而產(chǎn)生的一系列以骨骼發(fā)育異常為特征的疾病。近年研究發(fā)現(xiàn),編碼二型膠原蛋白的COL2A1基因是調(diào)控軟骨發(fā)育的重要基因,且當(dāng)COL2A1基因不同位點(diǎn)發(fā)生突變、或是突變類型不同時,會導(dǎo)致一系列嚴(yán)重程度差異很大的疾病表型,至今為止,COL2A1突變的病理學(xué)機(jī)制研究還沒有得出非常明確的結(jié)論。CRISPR/Cas9是2013年新開發(fā)的基因編輯工具,其機(jī)制是在gRNA的引導(dǎo)下Cas9核酸內(nèi)切酶能夠準(zhǔn)確尋找到目標(biāo)位點(diǎn)并且高效切割DNA片段,這一工具為基因突變的研究提供了堅(jiān)實(shí)的方法基礎(chǔ)。近年來,遺傳修飾豬模型在生物、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的科研作用,通過基因修飾,豬模型可以作為人類疾病的模型和異種器官供體,為人類健康做貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)旨在構(gòu)建攜帶有COL2A1基因突變的豬模型,用以進(jìn)一步研究COL2A1基因突變豬的表型和致病機(jī)制。研究方法:1.設(shè)計(jì)多對靶向COL2A1基因27號外顯子的gRNA,構(gòu)建包含有g(shù)RNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒。2.收集豬胚胎并進(jìn)行細(xì)胞分離和培養(yǎng),獲得符合轉(zhuǎn)染條件的豬胚胎成纖維細(xì)胞。3.通過電轉(zhuǎn)染的方式將gRNA/Cas... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

利用SCNT制備攜帶COL2A1突變的克隆豬（A）目標(biāo)位點(diǎn)的氨基酸序列在不同物種之間是高度保守的

gRNA脫靶檢測

第3章實(shí)驗(yàn)結(jié)果22和股骨頭發(fā)育不全，且長骨骨骺質(zhì)地柔軟，干骺端邊緣（尤其是關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的邊緣）不清晰。KO仔豬的肋骨長度也短于WT仔豬，這導(dǎo)致胸腔空間狹窄（圖3.4C）。圖3.4D為前后肢長骨和肋骨的長度數(shù)據(jù)。圖3.3COL2A1基因敲除（KO）仔豬的表型特征和骨骼X射線照片。（A）COL2A1KO仔豬和野生型（WT）仔豬出生后的外觀對比圖。（B）與WT仔豬相比，KO仔豬鼻部發(fā)育不全。（C）KO仔豬出現(xiàn)腭裂表現(xiàn)。（D）KO和WT仔豬的前肢和后肢具有明顯長度差異。（E）KO和WT仔豬的平均體重、體長、鼻子長度和胸腹圍比。（F）X線照片顯示了KO仔豬全身骨骼發(fā)育異常�？捎^察鼻梁凹陷和上頜骨較短（黃色箭頭所指），側(cè)位X線片顯示在KO仔豬中存在卵形椎體（藍(lán)色箭頭所指）。（G）與WT仔豬相比，KO仔豬的肋骨更薄更短，肩胛骨更小且分叉（黃色箭頭所指），以及椎骨發(fā)育不良（藍(lán)色箭頭所指）。（H）KO仔豬的前肢骨骼不發(fā)達(dá)，可以觀察到長骨變短，干骺端邊緣不清晰（黃色箭頭所指），掌骨和跖骨均變短（藍(lán)色箭頭所指）。


本文編號：3544030