本文關鍵詞：大麻素Ⅱ型受體調節(jié)阿爾茨海默病樣小鼠學習記憶能力的神經(jīng)源性炎癥機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:以大麻素Ⅱ型受體(cannabinoid receptor 2,CB2R)激動劑和CB2R基因敲除小鼠(CB2R knockout mice,CB2RKO)為工具,正反兩方面研究CB2R對阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠中β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)誘導的神經(jīng)源性炎癥和學習記憶能力的調節(jié)作用及可能機制,為CB2R成為AD等神經(jīng)退行性疾病抗炎治療新型藥物候選靶標提供更多的理論依據(jù)。方法:1行為學實驗分別選取6、8月齡APP/PS1轉基因AD模型小鼠(發(fā)病早、中期)開始接受連續(xù)8周選擇性CB2R激動劑JWH-015處理(腹腔注射,0.5mg/kg/天);于8、10月齡時通過新奇物體識別實驗、Morris水迷宮來評價JWH-015處理對APP/PS1小鼠非空間和空間學習記憶能力的影響;利用CB2RKO小鼠建立Aβ1-42雙側海馬CA1腦區(qū)注射AD模型(CB2RKO小鼠AD模型)研究JWH-015調節(jié)學習記憶能力作用與CB2R之間的特異性關系以及CB2R缺失對AD模型小鼠非空間學習記憶能力的影響。2 Aβ病理性沉積行為學實驗結束后,通過剛果紅染色觀察JWH-015處理對8、10月齡APP/PS1小鼠皮層、海馬腦區(qū)Aβ斑塊沉積數(shù)目的影響。3膠質細胞免疫反應性通過免疫熒光實驗檢測JWH-015處理和CB2R缺失對AD模型小鼠皮層、海馬腦區(qū)內小膠質細胞標志物離子型鈣結合受體分子1(ionized calcium-binding receptor adapter molecular 1,Iba1)和星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫熒光強度的影響。4小膠質細胞功能表型通過實時定量PCR技術檢測JWH-015處理和CB2R缺失對AD模型小鼠前額葉皮層(prefrontal cortex,PFC)和海馬腦區(qū)內M1型小膠質細胞標志物白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS),M2型小膠質細胞標志物幾丁質酶3樣蛋白(chitinase-3 like protein,Ym1/2)以及CB2R m RNA表達的影響。5神經(jīng)元樹突復雜性通過高爾基染色技術觀察JWH-015處理對8、10月齡APP/PS1小鼠PFC和海馬齒狀回(denate gyrus,DG)腦區(qū)內錐體神經(jīng)元樹突長度、分枝節(jié)點數(shù)和棘突密度的影響。6神經(jīng)干細胞增殖能力將5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,Brd U)腹腔注射摻入處于增殖期的神經(jīng)干細細胞后,通過免疫組化實驗檢測JWH-015處理對8、10月齡APP/PS1小鼠海馬DG區(qū)Brd U染色陽性細胞數(shù)目的影響。結果:1 CB2R與非空間學習記憶能力與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型組小鼠新奇物體識別指數(shù)均顯著降低(P0.001和P0.05),提示8、10月齡APP/PS1小鼠非空間學習記憶能力明顯受損;與同齡APP/PS1模型組相比,8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠新奇物體識別指數(shù)均顯著提高(P0.001和P0.05),提示JWH-015處理能夠顯著改善AD模型小鼠非空間學習記憶能力。為了研究JWH-015上述促認知能力作用與CB2R之間的特異性關系以及CB2R缺失對AD模型非空間學習能力損傷的影響,我們在CB2RKO小鼠AD模型上進行了新奇物體識別實驗。研究發(fā)現(xiàn),與CB2RKO小鼠空白對照組相比,CB2RKO小鼠AD模型組的新奇物體識別指數(shù)也顯著降低(P0.05),并且JWH-015處理對其新奇物體識別指數(shù)無顯著性影響,提示JWH-015特異性作用于CB2R提高AD模型小鼠PFC腦區(qū)依賴的非空間學習記憶能力。與WT小鼠AD模型組相比,CB2RKO小鼠AD模型組新奇物體識別指數(shù)顯著下降(P0.05),提示CB2R缺失加重AD模型小鼠非空間學習記憶能力損傷。以上研究表明,CB2R在AD模型的非空間學習記憶能力方面發(fā)揮重要調節(jié)作用。CB2R與空間學習記憶能力與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型組小鼠第5天上臺潛伏期均顯著延長(P0.05和P0.05)、第6天穿臺次數(shù)均顯著減少(P0.05和P0.05),提示AD模型小鼠空間學習記憶能力明顯受損;與同齡APP/PS1模型組相比,8月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠上臺潛伏期顯著縮短(P0.05),而10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠上臺潛伏期和穿臺次數(shù)均未見顯著改變,提示JWH-015激動CB2R對發(fā)病早期APP/PS1小鼠海馬依賴的空間學習記憶能力作用要強于發(fā)病中期。行為學實驗研究表明,CB2R對AD模型小鼠的PFC腦區(qū)依賴的非空間學習記憶能力的調節(jié)作用要強于海馬腦區(qū)依賴的空間學習記憶能力。為了研究CB2R對AD模型小鼠學習記憶能力調節(jié)作用是否與腦內Aβ相關病理改變有關,我們開展如下機制探索。2 CB2R與Aβ病理性沉積與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型組小鼠皮層、海馬腦區(qū)均出現(xiàn)剛果紅染色陽性的Aβ斑塊,且數(shù)目隨月齡增加而增多;與同齡APP/PS1模型組相比,8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠皮層、海馬腦區(qū)Aβ斑數(shù)目均未見顯著變化,提示JWH-015激動CB2R對AD模型小鼠腦內Aβ斑塊病理性沉積無影響。3 CB2R與膠質細胞免疫反應性與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型組小鼠皮層、海馬腦區(qū)內Iba1、GFAP免疫熒光強度均顯著增強(P0.05);與同齡APP/PS1模型組相比,8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠皮層腦區(qū)Iba1免疫熒光強度顯著下降(P0.05和P0.01),而海馬腦區(qū)Iba1和皮層、海馬腦區(qū)GFAP的免疫熒光強度均無顯著性影響,提示JWH-015處理能夠腦區(qū)特異性地降低小膠質細胞的免疫反應性。而為了研究JWH-015對小膠質細胞的免疫調節(jié)作用與CB2R之間的特異性關系并研究CB2R缺失對小膠質細胞免疫反應性的影響,我們在CB2RKO小鼠AD模型上檢測了小膠質細胞標志物Iba1的免疫熒光強度。研究發(fā)現(xiàn),與CB2RKO空白對照組相比,CB2RKO小鼠AD模型組的Iba1免疫熒光強度顯著增強(P0.05),且JWH-015處理對其Iba1免疫熒光強度無顯著性影響,提示JWH-015特異性作用于CB2R調節(jié)小膠質細胞的免疫反應性。同時,與WT小鼠AD模型組相比,CB2RKO小鼠AD模型組Iba1免疫熒光強度有增強的趨勢,且小膠質細胞激活形態(tài)明顯改變:胞體增大,分枝粗短而密集。此外,Aβ1-42雙側海馬CA1區(qū)注射AD模型小鼠各處理組間GFAP免疫熒光強度未見顯著差異,提示AD模型小鼠的行為學改變可能并不依賴于星形膠質細胞的免疫反應性。免疫熒光實驗結果表明,CB2R對AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內小膠質細胞的免疫反應性和激活形態(tài)發(fā)揮重要調節(jié)作用。為了驗證小膠質細胞激活形態(tài)的差異是否引起功能作用的轉變,我們進行了小膠質細胞功能表型的研究。4 CB2R與小膠質細胞功能表型與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型組小鼠PFC、海馬腦區(qū)內M1型小膠質細胞標志物IL-6、TNF-αm RNA表達水平不同程度地上調,提示AD模型小鼠腦內促炎型小膠質細胞表達增高;與同齡APP/PS1模型組相比,8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠PFC、海馬腦區(qū)IL-6、TNF-αm RNA表達不同程度地下調,M2型小膠質細胞標志物Ym1/2 m RNA表達水平顯著上調(P0.05),且JWH-015在PFC腦區(qū)上述作用程度較海馬腦區(qū)顯著,提示JWH-015激動CB2R能夠促進AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內小膠質細胞的功能表型轉化。而為了研究JWH-015調節(jié)小膠質細胞功能表型的作用與CB2R之間的特異性關系并研究CB2R缺失對小膠質細胞功能表型的影響,我們在CB2RKO小鼠AD模型上檢測了M1/M2型小膠質細胞標志物m RNA表達水平。研究發(fā)現(xiàn),與CB2RKO小鼠空白對照組相比,CB2RKO小鼠AD模型組PFC腦區(qū)內IL-6、TNF-α、i NOS m RNA表達水平顯著增高(P0.001、P0.01和P=0.0507),且Ym1/2 m RNA表達水平顯著降低(P0.05),同時JWH-015處理對其IL-6、TNF-α、i NOS和Ym1/2 m RNA表達水平無顯著性影響,提示JWH-015特異性作用于CB2R調節(jié)小膠質細胞功能表型的轉化。而與WT小鼠AD模型組相比,CB2RKO小鼠AD模型組PFC腦區(qū)內IL-6、TNF-αm RNA表達水平均顯著增加(P0.01和P0.05),提示CB2R缺失顯著增強AD模型小鼠M1型小膠質細胞表達。此外,與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型小鼠PFC、海馬腦區(qū)內CB2R m RNA表達水平均顯著升高(P0.05),但JWH-015處理對CB2R m RNA表達水平無顯著影響。上述研究結果表明,CB2R在AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內小膠質細胞的免疫反應性、激活形態(tài)和功能表型轉化方面發(fā)揮重要調節(jié)作用,并與其在認知能力方面的改善作用關系密切。5 CB2R與神經(jīng)元樹突復雜性與同齡野生型對照組相比,8、10月齡APP/PS1模型組小鼠PFC腦區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突長度、分枝節(jié)點數(shù)、棘突密度和DG腦區(qū)錐體神經(jīng)元棘突密度均顯著下降(P0.001),提示AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內神經(jīng)元樹突復雜性的下降可能與其認知能力損傷有關。與同齡APP/PS1模型組相比,8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠PFC腦區(qū)錐體神經(jīng)元樹突長度、樹突分枝節(jié)點數(shù)以及棘突密度均顯著性增加(P0.001),DG區(qū)神經(jīng)元棘突密度無顯著性影響,提示JWH-015激動CB2R能夠腦區(qū)依賴性地改善AD模型小鼠神經(jīng)元樹突復雜性,這可能是與CB2R在不同功能腦區(qū)的炎性調節(jié)作用有關,但目前研究結果無法確定兩者的關系。6 CB2R與神經(jīng)干細胞增殖能力與同齡野生型對照組相比,8月齡APP/PS1模型組小鼠海馬DG區(qū)Brd U陽性細胞數(shù)目無顯著性變化,而10月齡APP/PS1模型組小鼠則顯著減少(P0.01),提示發(fā)病中期AD模型小鼠出現(xiàn)神經(jīng)干細胞增殖能力下降。與同齡APP/PS1模型組相比,10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠海馬DG區(qū)Brd U陽性細胞數(shù)顯著增加(P0.05),提示JWH-015激動CB2R能夠顯著增強APP/PS1小鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)干細胞增殖能力,可能與CB2R調節(jié)海馬腦區(qū)炎性微環(huán)境的作用有關,但缺少直接的實驗證據(jù),需要進一步研究。結論:特異性激動CB2R能夠顯著提高AD模型小鼠非空間學習記憶能力,其機制可能與腦區(qū)特異性地調節(jié)小膠質細胞介導的神經(jīng)源性炎癥,改善神經(jīng)干細胞增殖能力和樹突復雜性有關;CB2R缺失會明顯改變AD模型小鼠腦內小膠質細胞激活形態(tài)和功能表型,加重非空間學習記憶損傷。因此,CB2R在AD病程進展中的神經(jīng)源性炎癥和學習記憶能力方面發(fā)揮重要調節(jié)作用,有希望成為AD抗炎治療的新型候選藥物靶點。
【關鍵詞】：大麻素Ⅱ型受體 阿爾茨海默病 小膠質細胞 神經(jīng)源性炎癥 神經(jīng)可塑性 學習記憶能力
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R614
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 前言16-19
• 材料與方法19-29
• 結果29-37
• 附圖37-50
• 附表50-51
• 討論51-61
• 結論61-62
• 參考文獻62-69
• 綜述 大麻素系統(tǒng)在阿爾茨海默病神經(jīng)源性炎癥中的調節(jié)作用69-88
• 參考文獻78-88
• 致謝88-90
• 個人簡歷90

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本文編號：289713