發(fā)布時(shí)間：2017-10-07 18:22

  本文關(guān)鍵詞：分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立及其對(duì)自噬功能的影響

  更多相關(guān)文章： 分枝菌酸 巨噬細(xì)胞 泡沫細(xì)胞 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B 自噬

【摘要】：目的： 1.建立分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，探討分枝菌酸包被聚苯乙烯微球誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞化的條件及特性。 2.建立穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-LC3B的RAW264.7細(xì)胞模型。 3.探討分枝菌酸所致巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞化對(duì)細(xì)胞自噬功能的影響。 方法： 1.將RAW264.7細(xì)胞分為空白對(duì)照組和分別包被0、25、50、75、100μg/mL分枝菌酸的聚苯乙烯微球?qū)嶒?yàn)組，分別將細(xì)胞與聚苯乙烯微球混勻，共同孵育24、48、72h、5d和8d后，油紅O染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用總膽固醇試劑盒和游離膽固醇試劑盒測(cè)定各組泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。 2.以RT-PCR法擴(kuò)增小鼠LC3B基因，雙酶切后插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，構(gòu)建pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒。 3.經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定后，將pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，經(jīng)G418壓力篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆并將其擴(kuò)大培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。 4.將細(xì)胞分為三組，分別為空白R(shí)AW264.7細(xì)胞組、pEGFP-LC3B/RAW264.7細(xì)胞組以及用75μg/mL MA誘導(dǎo)5d的pEGFP-LC3B/RAW264.7細(xì)胞組。RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Becn1及LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比值變化。 結(jié)果： 1.當(dāng)包被分枝菌酸濃度為75μg/mL、吞噬時(shí)間為24h時(shí)，RAW264.7能形成典型的泡沫細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯相對(duì)含量為60.98%±1.32%；隨著吞噬時(shí)間延長(zhǎng)，形成泡沫細(xì)胞所需的分枝菌酸的濃度逐漸遞減；且隨著細(xì)胞泡沫化程度增加，細(xì)胞增殖活力逐漸減弱。 2.經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定，pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3.將pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選后獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。 4.與對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)成為泡沫細(xì)胞后其Becn1基因轉(zhuǎn)錄水平和LC3B表達(dá)水平降低，蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。分枝菌酸包被聚苯乙烯微球可快速誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，分枝菌酸濃度與細(xì)胞泡沫化程度呈正相關(guān)，且呈時(shí)間依賴性。 2.成功構(gòu)建pEGFP-LC3B/RAW264.7細(xì)胞模型，，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞自噬過(guò)程及對(duì)自噬功能的研究奠定基礎(chǔ)。3.當(dāng)巨噬細(xì)胞被MA誘導(dǎo)成為泡沫巨噬細(xì)胞后其自噬水平降低。
【關(guān)鍵詞】：分枝菌酸 巨噬細(xì)胞 泡沫細(xì)胞 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B 自噬
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 第一部分 分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立及鑒定15-24
• 1 材料和方法15-18
• 2 結(jié)果與分析18-22
• 3 結(jié)論22-24
• 第二部分 重組質(zhì)粒 pEGFP-LC3B 的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及鑒定24-36
• 1 材料和方法24-32
• 2 結(jié)果與分析32-35
• 3 結(jié)論35-36
• 第三部分 分枝菌酸所致泡沫細(xì)胞化對(duì)巨噬細(xì)胞自噬功能的影響36-45
• 1 材料與方法36-42
• 2 結(jié)果與分析42-44
• 3 結(jié)論44-45
• 討論45-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 全文總結(jié)50-51
• 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)50
• 本研究的不足之處50-51
• 文獻(xiàn)綜述51-60
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章61-62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 韓中博;張鵬;付強(qiáng);李小蘭;葛軍娜;陶德定;胡俊波;龔建平;;腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)及其細(xì)胞周期分析[J];癌癥;2006年09期

本文編號(hào)：989377