本文關(guān)鍵詞：利用桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)攜帶抗體表達(dá)基因的雙鏈AAV的研究

  更多相關(guān)文章： 桿狀病毒 雙鏈AAV Avastin 病毒生產(chǎn)

【摘要】：眾所周知，單克隆抗體對(duì)于腫瘤療效顯著，，基因表達(dá)抗體的結(jié)果受所選用載體的影響較大，因此表達(dá)載體的選擇在基因治療腫瘤中起著至關(guān)重要的作用。多項(xiàng)臨床研究表明，腺相關(guān)病毒（AAV）不僅能夠有效地介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)且無(wú)劑量限制性毒性，因此國(guó)內(nèi)外研究中廣泛采用腺相關(guān)病毒載體來(lái)作為基因治療載體。常用的單鏈AAV載體具有致病原性低、宿主范圍廣、表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些不足，例如表達(dá)延遲、表達(dá)水平低等；而雙鏈AAV由于越過了由單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的過程從而克服了上述缺點(diǎn)。 雙鏈AAV的基因組在缺失D序列后，通過自身基因組的折疊形成dsDNA而無(wú)需宿主細(xì)胞介導(dǎo)的DNA合成或多個(gè)載體間的互補(bǔ)配對(duì)，從而直接被包裝成為攜帶雙鏈基因組的AAV載體，因此起效時(shí)間更快，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高。經(jīng)典的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)AAV具有繁瑣復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、且難以大規(guī)模培養(yǎng)的缺點(diǎn)，桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)以其高安全性、操作簡(jiǎn)單快捷、低成本、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)用于AAV載體的生產(chǎn)吸引了越來(lái)越多研究者的目光。國(guó)際上已有采用rcAAV表達(dá)單鏈抗體的先例，本課題首次嘗試在桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)雙鏈AAV，并包裝表達(dá)全長(zhǎng)抗體，為AAV—抗體的研究奠定基礎(chǔ)。 本課題的主要工作是通過基因改造，使得帶有dsITR序列的質(zhì)粒攜帶抗體表達(dá)基因經(jīng)過桿狀病毒重組后，與另一個(gè)表達(dá)AAV外殼的重組桿狀病毒共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，重組產(chǎn)生能夠表達(dá)抗體的雙鏈AAV。具體工作內(nèi)容及結(jié)果如下： （1）對(duì)pABVN-EF1a-EGFP質(zhì)粒進(jìn)行設(shè)計(jì)改造得到dspABVN-EF1a-EGFP質(zhì)粒，并將上述兩個(gè)質(zhì)粒分別與DH10Bac感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)座重組，并經(jīng)PCR反應(yīng)鑒定正確后經(jīng)過對(duì)sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染后獲得重組桿狀病毒ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP。 （2）對(duì)已有的重組桿狀病毒ABPM8進(jìn)行蛋白印跡（Western blot）檢測(cè)，結(jié)果表明ABPM8確已表達(dá)Cap蛋白，且三種蛋白的比例約為1:1:10。采用Real-time PCR進(jìn)行滴度檢測(cè)，結(jié)果表明獲得的ABPM8、ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP三種重組桿狀病毒滴度分別為3.1×10~(10)VG/ml、3.6×10~(10)VG/ml和3.025×10~(10)VG/ml。 （3）將表達(dá)外殼蛋白的ABPM8分別與桿狀病毒ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP在sf9細(xì)胞中進(jìn)行重組，成功生產(chǎn)出ssrAAV8-EGFP和scrAAV8-EGFP，收集純化后采用感染HEK293細(xì)胞來(lái)檢測(cè)病毒活性并對(duì)兩種AAV進(jìn)行比較，通過表達(dá)出的熒光可見scrAAV8-EGFP具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 （4）在上述基礎(chǔ)上本課題構(gòu)建完成了dspABVN-EF1a-AT7載體，轉(zhuǎn)座重組并經(jīng)PCR鑒定正確后轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得的dsABVNM-EF1a-AT7桿狀病毒滴度為3.1×109VG/ml，并與ABPM8重組后生產(chǎn)出scrAAV8-AT7，純化感染HEK293細(xì)胞后收集上清，蛋白印跡法檢測(cè)出阿瓦斯�。ˋvastin）重輕鏈的成功表達(dá)，ELISA檢測(cè)出Avastin的表達(dá)量可達(dá)770ng/ml。 上述結(jié)果表明本課題已初步探索出可以利用桿狀病毒系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)表達(dá)Avastin的雙鏈AAV，且生產(chǎn)出的病毒具有生物學(xué)活性并能實(shí)現(xiàn)外源基因的體外表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：桿狀病毒 雙鏈AAV Avastin 病毒生產(chǎn)
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-15
• 第一章 腫瘤治療的研究進(jìn)展15-25
• 1.1 前言15-23
• 1.1.1 抗體治療腫瘤相關(guān)15-16
• 1.1.2 Avastin16
• 1.1.3 桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）16-17
• 1.1.4 AAV 簡(jiǎn)介17-23
• 1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及課題內(nèi)容23-25
• 1.2.1 本課題的研究目的和意義23-24
• 1.2.2 本課題的研究?jī)?nèi)容24-25
• 第二章 單雙鏈帶有 EGFP 重組桿狀病毒的生產(chǎn)25-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)器材25-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑26-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-38
• 2.2.1 pABVN-EF1a-EGFP 菌株的鑒定28-30
• 2.2.2 dspABVN-EF1a-EGFP 菌株的構(gòu)建及鑒定30-31
• 2.2.3 單雙鏈帶有 EGFP 的 Bacmid 的獲得31-33
• 2.2.4 單雙鏈帶有 EGFP 的重組桿狀病毒的包裝及檢測(cè)33-36
• 2.2.5 重組桿狀病毒 ABPM8、ABVNM-EF1a-EGFP 和 dsABVNM-EF1a-EGFP 的滴度測(cè)定36-38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-46
• 2.3.1 pABVN-EF1a-EGFP 的酶切鑒定結(jié)果38-40
• 2.3.2 dspABVN-EF1a-EGFP 的鑒定結(jié)果40-42
• 2.3.3 ITR 部分的 PCR 檢測(cè)結(jié)果42
• 2.3.4 轉(zhuǎn)座重組的鑒定結(jié)果42-43
• 2.3.5 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染及擴(kuò)增結(jié)果43-44
• 2.3.6 重組桿狀病毒滴度結(jié)果44-46
• 2.4 討論46-47
• 2.5 小結(jié)47-48
• 第三章 rAAV8-EGFP 的生產(chǎn)、純化、鑒定48-57
• 3.1 實(shí)驗(yàn)器材48-50
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器48
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑48-50
• 3.2 試驗(yàn)方法50-54
• 3.2.1 cap 基因表達(dá)的 Western Blot 檢測(cè)50-52
• 3.2.2 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒的生產(chǎn)52
• 3.2.3 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒的純化52-53
• 3.2.4 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒活力的檢測(cè)53-54
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-56
• 3.3.1 重組桿狀病毒 ABPM8 cap 基因表達(dá)的 Western blot 檢測(cè)54
• 3.3.2 rAAV8-EGFP 的熒光表達(dá)54-55
• 3.3.3 rAAV8-EGFP 的活力檢測(cè)55-56
• 3.4 討論56
• 3.5 小結(jié)56-57
• 第四章 dspABVNM-EF1a-AT7 載體的構(gòu)建及 scrAAV8 的包裝鑒定57-77
• 4.1 實(shí)驗(yàn)器材57-58
• 4.1.1 材料與試劑57
• 4.1.2 儀器與設(shè)備57
• 4.1.3 試劑的配制57-58
• 4.2 試驗(yàn)方法58-66
• 4.2.1 dspABVNM-EF1a-AT7 的載體構(gòu)建58-62
• 4.2.2 dspABVNM-EF1a-AT7 重組桿狀病毒的生產(chǎn)、檢測(cè)62-64
• 4.2.3 scrAAV8-AT7 病毒的生產(chǎn)純化64-65
• 4.2.4 純化后 dsrAAV8-AT7 病毒滴度的檢測(cè)65
• 4.2.5 dsrAAV8-AT7 病毒活力的檢測(cè)65-66
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-75
• 4.3.1 dspABVN-EF1a-AT7 質(zhì)粒的構(gòu)建66-71
• 4.3.2 轉(zhuǎn)座重組的鑒定71
• 4.3.3 重組桿狀病毒 dsABVNM-EF1a-AT7 的鑒定71-72
• 4.3.4 重組桿狀病毒 dsABVNM-EF1a-AT7 的滴度檢測(cè)72-73
• 4.3.5 純化的 scrAAV8-AT7 的滴度檢測(cè)73-75
• 4.3.6 Avastin 表達(dá)的 Western Blot 檢測(cè)75
• 4.3.7 Avastin 表達(dá)量的 ELISA 檢測(cè)75
• 4.4 討論75-76
• 4.5 小結(jié)76-77
• 結(jié)論77-79
• 參考文獻(xiàn)79-84
• 致謝84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳穎偉;久保寺;李一;大西威一郎;仁科一隆;李定國(guó);橫田隆德;;8型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)短發(fā)夾狀RNA在小鼠肝臟的表達(dá)及其功能[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年12期

本文編號(hào)：987347