本文關鍵詞：利用桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)攜帶抗體表達基因的雙鏈AAV的研究

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【摘要】：眾所周知，單克隆抗體對于腫瘤療效顯著，，基因表達抗體的結果受所選用載體的影響較大，因此表達載體的選擇在基因治療腫瘤中起著至關重要的作用。多項臨床研究表明，腺相關病毒（AAV）不僅能夠有效地介導轉基因的表達且無劑量限制性毒性，因此國內外研究中廣泛采用腺相關病毒載體來作為基因治療載體。常用的單鏈AAV載體具有致病原性低、宿主范圍廣、表達時間長等優(yōu)點，但也存在一些不足，例如表達延遲、表達水平低等；而雙鏈AAV由于越過了由單鏈轉變?yōu)殡p鏈的過程從而克服了上述缺點。 雙鏈AAV的基因組在缺失D序列后，通過自身基因組的折疊形成dsDNA而無需宿主細胞介導的DNA合成或多個載體間的互補配對，從而直接被包裝成為攜帶雙鏈基因組的AAV載體，因此起效時間更快，轉導效率更高。經(jīng)典的三質粒轉染生產(chǎn)AAV具有繁瑣復雜、費時費力、且難以大規(guī)模培養(yǎng)的缺點，桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)以其高安全性、操作簡單快捷、低成本、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢用于AAV載體的生產(chǎn)吸引了越來越多研究者的目光。國際上已有采用rcAAV表達單鏈抗體的先例，本課題首次嘗試在桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)雙鏈AAV，并包裝表達全長抗體，為AAV—抗體的研究奠定基礎。 本課題的主要工作是通過基因改造，使得帶有dsITR序列的質粒攜帶抗體表達基因經(jīng)過桿狀病毒重組后，與另一個表達AAV外殼的重組桿狀病毒共轉染sf9細胞，重組產(chǎn)生能夠表達抗體的雙鏈AAV。具體工作內容及結果如下： （1）對pABVN-EF1a-EGFP質粒進行設計改造得到dspABVN-EF1a-EGFP質粒，并將上述兩個質粒分別與DH10Bac感受態(tài)進行轉座重組，并經(jīng)PCR反應鑒定正確后經(jīng)過對sf9細胞轉染后獲得重組桿狀病毒ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP。 （2）對已有的重組桿狀病毒ABPM8進行蛋白印跡（Western blot）檢測，結果表明ABPM8確已表達Cap蛋白，且三種蛋白的比例約為1:1:10。采用Real-time PCR進行滴度檢測，結果表明獲得的ABPM8、ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP三種重組桿狀病毒滴度分別為3.1×10~(10)VG/ml、3.6×10~(10)VG/ml和3.025×10~(10)VG/ml。 （3）將表達外殼蛋白的ABPM8分別與桿狀病毒ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP在sf9細胞中進行重組，成功生產(chǎn)出ssrAAV8-EGFP和scrAAV8-EGFP，收集純化后采用感染HEK293細胞來檢測病毒活性并對兩種AAV進行比較，通過表達出的熒光可見scrAAV8-EGFP具有明顯的優(yōu)勢。 （4）在上述基礎上本課題構建完成了dspABVN-EF1a-AT7載體，轉座重組并經(jīng)PCR鑒定正確后轉染sf9細胞，獲得的dsABVNM-EF1a-AT7桿狀病毒滴度為3.1×109VG/ml，并與ABPM8重組后生產(chǎn)出scrAAV8-AT7，純化感染HEK293細胞后收集上清，蛋白印跡法檢測出阿瓦斯�。ˋvastin）重輕鏈的成功表達，ELISA檢測出Avastin的表達量可達770ng/ml。 上述結果表明本課題已初步探索出可以利用桿狀病毒系統(tǒng)來生產(chǎn)表達Avastin的雙鏈AAV，且生產(chǎn)出的病毒具有生物學活性并能實現(xiàn)外源基因的體外表達。
【關鍵詞】：桿狀病毒 雙鏈AAV Avastin 病毒生產(chǎn)
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-15
• 第一章 腫瘤治療的研究進展15-25
• 1.1 前言15-23
• 1.1.1 抗體治療腫瘤相關15-16
• 1.1.2 Avastin16
• 1.1.3 桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）16-17
• 1.1.4 AAV 簡介17-23
• 1.2 實驗設計方案及課題內容23-25
• 1.2.1 本課題的研究目的和意義23-24
• 1.2.2 本課題的研究內容24-25
• 第二章 單雙鏈帶有 EGFP 重組桿狀病毒的生產(chǎn)25-48
• 2.1 實驗器材25-28
• 2.1.1 實驗材料25
• 2.1.2 實驗儀器25-26
• 2.1.3 實驗試劑26-28
• 2.2 實驗方法28-38
• 2.2.1 pABVN-EF1a-EGFP 菌株的鑒定28-30
• 2.2.2 dspABVN-EF1a-EGFP 菌株的構建及鑒定30-31
• 2.2.3 單雙鏈帶有 EGFP 的 Bacmid 的獲得31-33
• 2.2.4 單雙鏈帶有 EGFP 的重組桿狀病毒的包裝及檢測33-36
• 2.2.5 重組桿狀病毒 ABPM8、ABVNM-EF1a-EGFP 和 dsABVNM-EF1a-EGFP 的滴度測定36-38
• 2.3 實驗結果38-46
• 2.3.1 pABVN-EF1a-EGFP 的酶切鑒定結果38-40
• 2.3.2 dspABVN-EF1a-EGFP 的鑒定結果40-42
• 2.3.3 ITR 部分的 PCR 檢測結果42
• 2.3.4 轉座重組的鑒定結果42-43
• 2.3.5 重組桿狀病毒轉染及擴增結果43-44
• 2.3.6 重組桿狀病毒滴度結果44-46
• 2.4 討論46-47
• 2.5 小結47-48
• 第三章 rAAV8-EGFP 的生產(chǎn)、純化、鑒定48-57
• 3.1 實驗器材48-50
• 3.1.1 實驗材料48
• 3.1.2 實驗儀器48
• 3.1.3 實驗試劑48-50
• 3.2 試驗方法50-54
• 3.2.1 cap 基因表達的 Western Blot 檢測50-52
• 3.2.2 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒的生產(chǎn)52
• 3.2.3 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒的純化52-53
• 3.2.4 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒活力的檢測53-54
• 3.3 實驗結果54-56
• 3.3.1 重組桿狀病毒 ABPM8 cap 基因表達的 Western blot 檢測54
• 3.3.2 rAAV8-EGFP 的熒光表達54-55
• 3.3.3 rAAV8-EGFP 的活力檢測55-56
• 3.4 討論56
• 3.5 小結56-57
• 第四章 dspABVNM-EF1a-AT7 載體的構建及 scrAAV8 的包裝鑒定57-77
• 4.1 實驗器材57-58
• 4.1.1 材料與試劑57
• 4.1.2 儀器與設備57
• 4.1.3 試劑的配制57-58
• 4.2 試驗方法58-66
• 4.2.1 dspABVNM-EF1a-AT7 的載體構建58-62
• 4.2.2 dspABVNM-EF1a-AT7 重組桿狀病毒的生產(chǎn)、檢測62-64
• 4.2.3 scrAAV8-AT7 病毒的生產(chǎn)純化64-65
• 4.2.4 純化后 dsrAAV8-AT7 病毒滴度的檢測65
• 4.2.5 dsrAAV8-AT7 病毒活力的檢測65-66
• 4.3 實驗結果66-75
• 4.3.1 dspABVN-EF1a-AT7 質粒的構建66-71
• 4.3.2 轉座重組的鑒定71
• 4.3.3 重組桿狀病毒 dsABVNM-EF1a-AT7 的鑒定71-72
• 4.3.4 重組桿狀病毒 dsABVNM-EF1a-AT7 的滴度檢測72-73
• 4.3.5 純化的 scrAAV8-AT7 的滴度檢測73-75
• 4.3.6 Avastin 表達的 Western Blot 檢測75
• 4.3.7 Avastin 表達量的 ELISA 檢測75
• 4.4 討論75-76
• 4.5 小結76-77
• 結論77-79
• 參考文獻79-84
• 致謝84

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳穎偉;久保寺;李一;大西威一郎;仁科一隆;李定國;橫田隆德;;8型腺相關病毒介導短發(fā)夾狀RNA在小鼠肝臟的表達及其功能[J];上海交通大學學報(醫(yī)學版);2007年12期

本文編號：987347