本文關(guān)鍵詞：漢灘病毒感染HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生及其分子機(jī)制的初步研究

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【摘要】：漢坦病毒（Hantavirus）是布尼亞病毒科（Bunyaviridae）漢坦病毒屬（Hantaviruses）家族成員，其基因組由大（L）、中（M）和�。⊿）三條單股負(fù)鏈RNA組成。L片段編碼RNA依賴的RNA聚合酶（Pol），S片段編碼病毒核衣殼蛋白（neucleocapsidprotein，NP），M片段編碼病毒的糖蛋白前體。漢坦病毒屬的漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）、漢城病毒（Seoul virus，SEOV）、普馬拉病毒（Puumala virus，PUUV）等感染引起的腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）主要流行于亞洲和歐洲國(guó)家；安第斯病毒（Andes virus，ANDV）、紐約病毒（New York virus，NYV）和辛諾柏病毒（Sin Nombre virus，SNV）等引起的漢坦病毒肺綜合征（hantaviruspulmonary syndrome，，HPS）主要流行于美洲國(guó)家，兩者均屬于病死率較高和病情較為嚴(yán)重的急性傳染病。我國(guó)是HFRS的流行大國(guó)，發(fā)病人數(shù)居全球首位。其臨床特征主要以發(fā)熱、出血、低血壓休克和急性腎臟功能損傷為主。 HFRS的發(fā)病機(jī)制及病理過(guò)程較為復(fù)雜。目前研究認(rèn)為病毒一方面可直接感染臟器組織致使結(jié)構(gòu)和功能異常，另一方面病毒感染機(jī)體激活機(jī)體的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，致使機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，釋放炎癥介質(zhì)、血管活性因子和多種細(xì)胞因子，而最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂和器官功能失調(diào)。 漢坦病毒的主要存儲(chǔ)宿主是嚙齒類動(dòng)物。其傳播途徑多樣，一般認(rèn)為是人通過(guò)接觸帶毒嚙齒類動(dòng)物的排泄物與分泌物經(jīng)傷口、氣溶膠、飲食而感染，其中被帶毒嚙齒類動(dòng)物輕微咬傷也可導(dǎo)致感染，而關(guān)于咬傷引起病毒感染的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)及發(fā)生的詳細(xì)分子事件尚不清楚。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）是人表皮組織的主要組成細(xì)胞，也被認(rèn)為是具有重要功能的非專業(yè)性抗原呈遞細(xì)胞（antigen presentingcell，APC），可分泌眾多細(xì)胞因子如干擾素、白細(xì)胞介素（IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-l8等）、集落刺激因子（G-CSF、GM-CSF）、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子等來(lái)抑制外來(lái)病原體的感染，也可通過(guò)表達(dá)MHCⅡ類抗原、吞噬加工抗原等參與抗原遞呈而發(fā)揮免疫防御作用。我們推測(cè)在經(jīng)帶毒嚙齒類動(dòng)物咬傷而感染漢坦病毒這一過(guò)程中，病毒有可能感染人KC細(xì)胞并誘導(dǎo)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)，為控制病毒感染或病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散提供可能。為此，本研究以永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT細(xì)胞，具有正常角質(zhì)形成細(xì)胞的全部特性）為研究模型，觀察HTNV是否感染KC細(xì)胞，以及感染KC細(xì)胞之后能否激活Ⅰ型干擾素固有免疫應(yīng)答以應(yīng)對(duì)病毒感染，并進(jìn)一步探討Ⅰ型干擾素應(yīng)答中存在的可能機(jī)制，為闡明漢坦病毒感染致病過(guò)程中KC細(xì)胞可能作為一種潛在的靶細(xì)胞及發(fā)生的分子事件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【主要實(shí)驗(yàn)方法和研究結(jié)果】 1. HTNV可感染HaCaT細(xì)胞，并能夠在其中復(fù)制增殖 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞，6h和24h時(shí)分別收集細(xì)胞，在對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白定量后，以核蛋白（nucleocapsid protein，NP）的單抗為一抗，采用Western blot檢測(cè)其中病毒的NP。結(jié)果顯示，病毒感染組在6h和24h均檢測(cè)到特異條帶，與NP的預(yù)期大小一致，而且24h的條帶明顯較強(qiáng)，未加病毒感染的對(duì)照組6h和24h均未檢測(cè)到相應(yīng)的特異條帶。以NP的單抗為一抗，用免疫熒光法檢測(cè)病毒感染72h時(shí)細(xì)胞內(nèi)病毒的NP，結(jié)果顯示，在胞漿中觀察到較強(qiáng)的特異性綠色熒光，即NP有特異的表達(dá)；未加病毒對(duì)照組中，胞漿內(nèi)沒(méi)有觀察到特異的綠色熒光顆粒。以上結(jié)果表明，HTNV可感染HaCaT細(xì)胞，并能夠在其中復(fù)制增殖。 2. HTNV感染HaCaT細(xì)胞后可誘導(dǎo)表達(dá)IFNβ 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞后，于1d和3d分別收集細(xì)胞，qRT-PCR分別檢測(cè)Ⅰ型干擾素IFNα和IFNβ的mRNA。結(jié)果顯示，與未感染對(duì)照組相比，病毒感染后細(xì)胞內(nèi)IFNβ mRNA水平在1d和3d時(shí)均顯著升高，而IFNα mRNA水平在1d和3d時(shí)變化均不明顯。結(jié)果表明，HTNV感染HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)了Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，且以IFNβ為主。 3. HTNV感染HaCaT細(xì)胞可激活I(lǐng)FNβ啟動(dòng)子 用Lipofectamine2000介導(dǎo)pRL-TK和含IFNβ啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒IF△116共轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，于6h后進(jìn)行HTNV感染，24h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒IF△116轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后經(jīng)HTNV感染，與未感染的細(xì)胞組相比熒光素酶活性明顯增強(qiáng)。該結(jié)果提示，HTNV感染后能明顯激活I(lǐng)FNβ啟動(dòng)子。 4. HTNV感染HaCaT細(xì)胞可激活Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路中相關(guān)效應(yīng)分子 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞2h后繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞，并提取細(xì)胞RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR分別檢測(cè)了Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平。 模式識(shí)別受體（PRR）檢測(cè)結(jié)果顯示，與未感染對(duì)照組相比，病毒感染細(xì)胞組RIG-Ⅰ的mRNA水平在1d和3d時(shí)均顯著升高；MDA5的mRNA水平在1d時(shí)變化不明顯，在3d時(shí)mRNA水平顯著升高；而病毒感染細(xì)胞TLR3的mRNA水平在1d和3d時(shí)均無(wú)明顯升高。該結(jié)果表明，在HTNV激活的干擾素應(yīng)答通路中，RIG-Ⅰ可能在病毒感染初期參與了HTNV的識(shí)別過(guò)程并進(jìn)一步激活了下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；隨后RIG-Ⅰ和MDA5在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)應(yīng)答過(guò)程中共同發(fā)揮了重要作用；TLR3可能不參與HTNV感染HaCaT細(xì)胞的識(shí)別過(guò)程。 轉(zhuǎn)錄因子IRF3和IRF7檢測(cè)結(jié)果顯示，與病毒未感染對(duì)照組相比，病毒感染細(xì)胞組IRF3和IRF7的mRNA水平在1d時(shí)變化均不明顯，3d時(shí)二者的mRNA水平均明顯升高，其中IRF7的mRNA水平上調(diào)更為顯著；在病毒感染HaCaT細(xì)胞4h、6h和24h時(shí)，免疫熒光法檢測(cè)IRF3、IRF7和NF-κB/p65入核情況，結(jié)果顯示在感染6h時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)能觀察到明顯的IRF3綠色熒光，而IRF3在4h和24h時(shí)，IRF7和NF-κB/p65在4h、6h和24h時(shí)均未觀察到細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光；隨后的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)NF-κB結(jié)合區(qū)激活情況檢測(cè)結(jié)果顯示，HTNV感染后，NF-κB信號(hào)沒(méi)有被明顯激活。以上結(jié)果提示，在病毒感染初期，活化的IRF3而非NF-κB可能首先入核介導(dǎo)了早期IFNβ基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，IRF7則可能在隨后Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮主要作用。 轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF9檢測(cè)結(jié)果顯示，與未感染對(duì)照組相比，病毒感染細(xì)胞組STAT1及IRF9的mRNA水平在1d時(shí)升高均不明顯，在3d時(shí)二者的mRNA水平均明顯升高；病毒感染HaCaT細(xì)胞4h、6h和24h時(shí)免疫熒光法檢測(cè)STAT1入核情況時(shí)，結(jié)果顯示在感染細(xì)胞24h時(shí)核內(nèi)能觀察到明顯的綠色熒光，而4h和6h時(shí)未觀察到核內(nèi)有綠色熒光；隨后用用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)STAT1結(jié)合區(qū)激活情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HTNV感染后，STAT1信號(hào)被明顯激活。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在干擾素誘導(dǎo)生成的下游通路中磷酸化的STAT1和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異三聚體后入核而啟動(dòng)眾多ISG基因的轉(zhuǎn)錄和合成。 干擾素刺激因子（ISG）檢測(cè)結(jié)果顯示，與未感染對(duì)照組相比，病毒感染細(xì)胞組MxA、OAS1和IFIT1的mRNA水平在1d、3d和5d時(shí)均顯著升高；IFIT3的mRNA水平在1d時(shí)升高不明顯，在3d和5d時(shí)也明顯升高。MxA和OAS1的mRNA水平呈先上升后下降趨勢(shì)；IFIT1和IFIT3的表達(dá)呈持續(xù)上升趨勢(shì)。結(jié)果表明，HTNV感染的HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的MxA和OAS1可能在感染早期發(fā)揮主要的抗病毒作用；IFIT1和IFIT3可能在病毒感染后期發(fā)揮重要的抗病毒作用。5. HTNV感染HaCaT細(xì)胞可誘導(dǎo)表達(dá)趨化因子CCL5和CXCL10 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞，同時(shí)設(shè)病毒未感染對(duì)照組，于1d、3d和5d時(shí)分別收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)CCL5和CXCL10的mRNA水平。結(jié)果顯示，HTNV感染后CCL5和CXCL10均被大量誘導(dǎo)表達(dá)，且CXCL10在1d時(shí)表達(dá)較為顯著。結(jié)果提示，CCL5在其受體的介導(dǎo)下可能主要參與病程后期的病毒清除及炎癥反應(yīng)，而CXCL10可能在感染初期即參與了機(jī)體強(qiáng)烈的抗病毒反應(yīng)。 【結(jié)論】 綜上所述，HTNV能夠感染人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞，感染細(xì)胞后誘導(dǎo)了IFNβ的產(chǎn)生，IFNβ又可引起細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的ISG發(fā)揮抗病毒作用，與此同時(shí)HTNV感染HaCaT細(xì)胞還可產(chǎn)生趨化因子，趨化因子可能參與了機(jī)體的抗病毒應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。本研究為進(jìn)一步探索帶毒嚙齒類動(dòng)物咬傷時(shí)KC細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：腎綜合征出血熱 漢灘病毒 人永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞） Ⅰ型干擾素
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-13
• Abstract13-18
• 前言18-21
• 文獻(xiàn)回顧21-35
• 1 材料35-39
• 1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒35
• 1.2 主要儀器35-36
• 1.3 主要試劑及配制36-39
• 2 方法39-45
• 2.1 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞及其檢測(cè)39-40
• 2.2 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后Ⅰ型干擾素的檢測(cè)40-43
• 2.3 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后 PRRs 的 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)43
• 2.4 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后 IRF3、IRF7 和 NF-κB 的檢測(cè)43-44
• 2.5 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后 STAT1 和 IRF9 的檢測(cè)44
• 2.6 ISG 和趨化因子的 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)44-45
• 3 結(jié)果45-53
• 3.1 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果45-46
• 3.2 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后Ⅰ型干擾素的檢測(cè)結(jié)果46-47
• 3.3 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后 PRRs 的 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果47-48
• 3.4 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后 IRF3、IRF7 和 NF-κB 的檢測(cè)結(jié)果48-50
• 3.5 HTNV 感染 HaCaT 細(xì)胞后 STAT1 和 IRF9 的檢測(cè)結(jié)果50-51
• 3.6 ISG 和趨化因子的 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果51-53
• 4 討論53-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果73-74
• 致謝74-75

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：982837