本文關(guān)鍵詞：臨床分離黏質(zhì)沙雷菌染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的檢測及其與β-內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因的相關(guān)性研究

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【摘要】：目的 了解安徽地區(qū)2005~2010年臨床分離的104株黏質(zhì)沙雷菌耐藥情況和染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的種類、分布，為臨床合理選擇抗菌藥物提供依據(jù)。 研究臨床分離黏質(zhì)沙雷菌染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因與β-內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因的相關(guān)性。 材料與方法 菌株來源 104株黏質(zhì)沙雷菌臨床分離株來自安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心2005年~2010年每年9月份收集的監(jiān)測網(wǎng)所屬34所醫(yī)院(由皖南、皖中、皖北不同級別的醫(yī)院組成)住院和門診患者的各類臨床標(biāo)本。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，轉(zhuǎn)移接合試驗受體菌大腸埃希菌J53AZR為安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心保存。 方法 1.采用瓊脂倍比稀釋法進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗，藥物敏感性試驗質(zhì)控菌采用E.coliATCC25922。 2.用煮沸法提取細(xì)菌總DNA，堿裂解法提取質(zhì)粒；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增染色體gyrA與parC基因和質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥(PMQR)基因；PCR產(chǎn)物純化測序，結(jié)果與Genbank中基因序列進(jìn)行比對，以明確gyrA與parC基因是否突變以及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因的基因型。 3.用PMQR基因陽性菌株與大腸埃希菌J53AzR行轉(zhuǎn)移接合試驗；采用瓊脂倍比稀釋法對受體菌與接合子進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)測定。 4.臨床分離菌株的總DNA為模板，PCR方法擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因；對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果與Genbank中基因序列進(jìn)行比對，以明確基因型。然后用接合子的質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因，驗證這些耐藥基因是否同時發(fā)生轉(zhuǎn)移。 結(jié)果 1.粘質(zhì)沙雷菌在呼吸道痰標(biāo)本中檢出率最高，達(dá)59.6%；主要分布于呼吸內(nèi)科、重癥監(jiān)護(hù)病房、老年病科等；藥敏結(jié)果顯示，粘質(zhì)沙雷菌對1、2代頭孢菌素表現(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥率在79.8%-91.3%以上；對左氧氟沙星、加替沙星，4代頭孢菌素比較敏感，敏感率在70%以上；未發(fā)現(xiàn)對亞胺培南、美羅培南耐藥菌株；頭孢西丁耐藥株對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率均較高，且與非耐藥株的藥敏結(jié)果進(jìn)行比較兩者之間耐藥性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 2.104株黏質(zhì)沙雷菌中檢出6株攜帶qnr基因和(或)aac(6′)-Ib-cr基因，其中3株攜帶qnr基因；4株攜帶aac(6′)-Ib-cr基因(其中1株同時攜帶qnr基因)；未檢測出qnrA、qnrC、qnrD及qepA基因。9株檢測出gyrA基因突變，7株檢測出parC基因突變。qnr基因：qnr基因陽性菌株經(jīng)測序并與GenBank上的基因序列進(jìn)行比對，確定2株qnrB基因陽性菌均為qnrB6亞型，1株qnrS基因陽性菌株為qnrS2亞型。qnrB6與qnrS2的GenBank注冊號分別為JQ034317和JQ041635。aac(6′)-Ib-cr基因：4株經(jīng)PCR產(chǎn)物電泳檢測出現(xiàn)300bp左右的目的條帶，為aac(6′)-Ib基因陽性菌株，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序確定為aac(6′)-Ib-cr，GenBank注冊號為JQ034318。 gyrA與parC基因突變：9株gyrA陽性的菌株均有第83位氨基酸密碼子突變，由TCG變?yōu)門TG，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸由Ser變?yōu)長eu，或同時有第87位氨基酸密碼子由GAC變?yōu)锳AC，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸由Asp變?yōu)锳sn；7株parC陽性的菌株均有第80位氨基酸密碼子突變，由AGC變?yōu)锳TT，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸由Ser變?yōu)镮le，其中3株同時存在第57、129、131與134位氨基酸密碼子突變。gyrA的GenBank注冊號為JQ034320和JQ235843；parC的GenBank注冊號為JQ034319和JQ235844。 3.6株攜帶qnr基因和(或)aac(6′)-Ib-cr基因的菌株中有5株轉(zhuǎn)移接合成功，接合子經(jīng)生化鑒定為大腸埃希菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增及DNA測序分析證實，2株接合子(T22、T91)攜帶qnrB6基因；1株接合子(T64)攜帶qnrS2基因；3株接合子(T60、T86、T91)攜帶aac(6′)-Ib-cr基因。藥敏結(jié)果表明，這5株接合子與受體菌相比，對環(huán)丙沙星的耐藥率至少提高了8~32倍。 4.11株gyrA，parC突變株與qnr，aac(6′)-Ib-cr陽性株中，分別檢測到SHV型3株，CTX-M型2株，OXA型4株和TEM型2株。測序結(jié)果經(jīng)BLAST系統(tǒng)比對，分別為：blaSHV-5，blaCTX-M-14，blaOXA-1，blaTEM-1。檢測到16S rRNA甲基化酶基因陽性株2株，，其測序結(jié)果經(jīng)BLAST系統(tǒng)比對均為armA型。β-內(nèi)酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因可以聯(lián)合PMQR基因同時發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。 結(jié)論 1.安徽地區(qū)黏質(zhì)沙雷菌對多種抗菌藥物耐藥，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，應(yīng)加強細(xì)菌耐藥監(jiān)測。 2.證實了在安徽地區(qū)存在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥的黏質(zhì)沙雷菌，也是國內(nèi)第一次在黏質(zhì)沙雷菌中檢出qnr基因。 3.陽性菌株接合子對喹諾酮類抗菌藥物的MIC和受體菌相比較有一定程度的提高。 4.黏質(zhì)沙雷菌中已經(jīng)出現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，且可以與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因同時存在。 5.染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因常與β-內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶同時存在于同一株黏質(zhì)沙雷菌中，導(dǎo)致多重耐藥。
【關(guān)鍵詞】：黏質(zhì)沙雷菌 喹諾酮類 染色體 質(zhì)粒 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416;R446.5
【目錄】：

• 目錄4-6
• 縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 第一部分 安徽省部分醫(yī)院臨床分離的黏質(zhì)沙雷菌耐藥性分析及喹諾酮類耐藥基因的檢測13-35
• 前言13-14
• 材料與方法14-20
• 結(jié)果20-27
• 討論27-30
• 結(jié)論30-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 第二部分 （臨床分離黏質(zhì)沙雷菌染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因與β-內(nèi)酰胺酶和 16S rRNA 甲基化酶基因的相關(guān)性研究）35-52
• 前言35-36
• 材料與方法36-41
• 結(jié)果41-46
• 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 附錄52-55
• 個人簡歷52
• 碩士期間科研學(xué)習(xí)成果52-55
• 致謝55-56
• 綜述56-67
• 參考文獻(xiàn)62-67

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：974423