本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座子突變文庫構(gòu)建與持留性突變株研究

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【摘要】：持留菌(persisters/persister cells)是存在于細(xì)菌群體中的一部分表型變異亞群，可以耐受致死濃度抗菌藥物的作用而存活下來。由于持留菌的存在，抗菌藥物的殺菌曲線常呈現(xiàn)出雙相性，即初期由于正常細(xì)菌的大量死亡曲線呈現(xiàn)出快速下降趨勢，后期由于持留菌的存在，曲線呈現(xiàn)出比較平緩穩(wěn)定的趨勢。持留菌不具有遺傳穩(wěn)定性，當(dāng)存活下來的持留菌被再次接種到新鮮培養(yǎng)基后，細(xì)菌中仍只有一小亞群為持留菌，而細(xì)菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度無變化。持留菌與生物被膜形成及其相關(guān)感染具有密切關(guān)系，也是難治性慢性感染的重要兇手，其在抗感染治療中的重要地位逐漸被認(rèn)可，甚至有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌持留性在臨床上的重要性并不亞于細(xì)菌抗菌藥物耐藥性。 持留菌最初由Bigger于1944年在葡萄球菌的殺菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，但長期以來持留菌的研究卻以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及結(jié)核分枝桿菌為主。金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌; Staphylococcus aureus)是醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一，既可引起皮膚、粘膜等處的輕型化膿性感染，也可導(dǎo)致菌血癥、毒性休克綜合征等危及患者生命的嚴(yán)重疾病。而耐藥性的產(chǎn)生與廣泛傳播嚴(yán)重干擾著金葡菌的臨床防治，使得近年來金葡菌感染逐步呈現(xiàn)發(fā)病率高、耐藥性強(qiáng)、治療困難、病死率高的態(tài)勢�；诔至艟敖鹌暇谂R床感染性疾病中的重要地位，探尋金葡菌持留菌的形成機(jī)制對于有效控制金葡菌感染具有重要意義。 探尋持留菌的形成機(jī)制，，關(guān)鍵在于分離鑒定與持留菌形成相關(guān)的基因。而文庫篩選是鑒定持留相關(guān)基因的最常用方法。在既往研究中，已有學(xué)者通過建立大腸埃希菌或銅綠假單胞菌的轉(zhuǎn)座子突變文庫、定點(diǎn)突變文庫及表達(dá)文庫篩選得到了一些與細(xì)菌持留性相關(guān)的基因，這些基因的發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了人們對持留菌的認(rèn)識。基于以上考量，我們擬通過建立金葡菌轉(zhuǎn)座子突變文庫篩選鑒定金葡菌持留性相關(guān)基因，而文庫的建立不僅可以用于篩選持留突變株，更可廣泛用于其他研究。 為了規(guī)避文庫篩選可能存在的不確定性，我們同時(shí)進(jìn)行了金葡菌持留相關(guān)基因的定點(diǎn)研究。目前已知的持留性相關(guān)基因中，有很多與細(xì)菌的代謝活動(dòng)相關(guān)，學(xué)術(shù)界目前普遍認(rèn)為細(xì)菌的代謝活動(dòng)與細(xì)菌持留性之間有著密切的關(guān)系。細(xì)菌的能量生成、氨基酸代謝、三磷酸甘油代謝、嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)等代謝活動(dòng)的異常使得細(xì)菌進(jìn)入非正常的生理狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)菌持留菌的產(chǎn)生�；騡lpD編碼產(chǎn)物GlpD為三磷酸甘油脫氫酶，在細(xì)菌的代謝活動(dòng)中具有重要作用，其很可能與細(xì)菌的持留性相關(guān)。glpD基因?qū).coli持留性的作用已經(jīng)有所研究，雖然可以肯定glpD在細(xì)菌持留水平的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著某種作用，但具體是正性還是負(fù)性作用尚存爭議。目前關(guān)于金葡菌glpD基因在持留性上的作用還無人涉足。為此，我們擬深入研究glpD基因在金葡菌持留菌形成中發(fā)揮的作用，以更好地揭示glpD基因與細(xì)菌持留性的關(guān)系，同時(shí)為探明金葡菌持留菌的形成機(jī)制提供借鑒。 本論文的第一部分我們利用轉(zhuǎn)座子Tn917構(gòu)建了金葡菌Newman株轉(zhuǎn)座子突變文庫，從該文庫中得到了持留性突變菌株，對其進(jìn)行了分析討論；同時(shí)，我們以構(gòu)建的轉(zhuǎn)座子為工具，篩選得到了一株DAP耐藥突變株。第二部分我們通過構(gòu)建glpD敲除株及進(jìn)行持留性對比實(shí)驗(yàn)，首次闡釋了glpD基因在金葡菌持留菌形成中的作用。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座子突變文庫的構(gòu)建與應(yīng)用 (1)構(gòu)建金葡菌Tn917轉(zhuǎn)座子突變文庫：將含有轉(zhuǎn)座子Tn917的溫敏穿梭質(zhì)粒pID408先電轉(zhuǎn)化入金葡菌RN4220，經(jīng)其對質(zhì)粒進(jìn)行修飾后，再將質(zhì)粒提取并電轉(zhuǎn)化入金葡菌Newman株，通過高溫及紅霉素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，從而得到含有大量轉(zhuǎn)座子插入突變的文庫。文庫初步建立后，我們對文庫質(zhì)量進(jìn)行了評價(jià)，文庫子數(shù)量遠(yuǎn)足以滿足實(shí)驗(yàn)需求，同時(shí)經(jīng)鑒定文庫子轉(zhuǎn)座子插入隨機(jī)性也較好，故文庫的可應(yīng)用性得到了保證。 (2)通過文庫獲得持留突變菌株，發(fā)現(xiàn)持留相關(guān)基因pyrD：在文庫的評價(jià)鑒定過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一株pyrD基因插入突變株(T18)。pyrD基因與細(xì)菌的呼吸作用及嘧啶合成代謝過程密切相關(guān)，鑒于持留菌與細(xì)菌代謝活動(dòng)的密切關(guān)系，我們將該突變株作為持留性實(shí)驗(yàn)對象之一。同時(shí)由于嘧啶合成缺陷及呼吸鏈?zhǔn)軗p菌株在某些特殊情況下會產(chǎn)生小菌落變異等變化，從而影響細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，故我們將T18株經(jīng)環(huán)丙沙星作用后得到了其衍生株T18s。我們比較了野生株、T18、T18s株的24h和36h菌液的持留性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①比較處于24h時(shí)間點(diǎn)的這三株細(xì)菌，24h的T18株活菌數(shù)量雖然相較野生株與T18s株偏少，但其經(jīng)8h DAP作用后，剩余的活菌數(shù)量卻是最多的，即T18株的持留性是最高的。而到了培養(yǎng)36h后，三株細(xì)菌的持留性對比關(guān)系發(fā)生了很大變化。②將培養(yǎng)36h的三株細(xì)菌的持留性與24h對應(yīng)菌株的持留性進(jìn)行比較，可見T18株的持留性顯著降低，而T18s株的持留性并未產(chǎn)生顯著變化，尤其值得注意的是，野生株的持留性升高了約103倍。③T18s株與野生株、T18株相比，其遲緩期明顯延長，有文獻(xiàn)認(rèn)為細(xì)菌的這種生長特點(diǎn)與其持留性增加有密切的關(guān)系，但在本實(shí)驗(yàn)中，T18s株的持留性非但沒有增加，反而有所降低。上述結(jié)果①②說明野生株、T18、T18s株之間存在持留性差異，而pyrD基因與金葡菌持留性相關(guān)，同時(shí)T18s株的某些基因變化在一定程度上補(bǔ)償了T18株相較于野生株的持留性變化，但其具體的基因變化尚有待探討。同時(shí)，野生株、T18株及T18s株的36h菌液相較于24h菌液的持留性分別呈現(xiàn)出了升高、降低、不變?nèi)N情況，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析持留性產(chǎn)生差異的原因提供了很好的素材。而結(jié)果③則提示我們，細(xì)菌生長遲緩期的長短與細(xì)菌持留性之間的具體關(guān)系尚有待進(jìn)一步探討。 (3)由文庫篩選得到DAP耐藥突變株，且耐藥性的產(chǎn)生與acuAC轉(zhuǎn)錄單位相關(guān)：經(jīng)過轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)測定，我們篩選得到的DAP耐藥突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于acuAC轉(zhuǎn)錄單位啟動(dòng)子的-35區(qū)，提示該轉(zhuǎn)錄單位破壞導(dǎo)致了DAP耐藥性產(chǎn)生，而進(jìn)一步的RT-PCR結(jié)果顯示，該突變株中AcuA和AcuC的表達(dá)水平均明顯低于野生株。acuAC轉(zhuǎn)錄單位引起DAP耐藥的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討，后續(xù)的研究可能解釋DAP耐藥的新機(jī)制，甚至擴(kuò)展出DAP耐藥研究的新方向。 2.金葡菌glpD基因與金葡菌持留性關(guān)系研究 (1) glpD與細(xì)菌持留性關(guān)系的研究現(xiàn)狀：glpD基因是與細(xì)菌代謝活動(dòng)密切相關(guān)的基因，而過往在大腸埃希菌中，關(guān)于glpD對持留菌形成具有正性或負(fù)性調(diào)節(jié)作用的觀點(diǎn)尚存爭議，我們選擇在金葡菌中對這一問題做進(jìn)一步探討。 (2)構(gòu)建金葡菌glpD敲除突變株：以pYT3質(zhì)粒為骨架構(gòu)建敲除質(zhì)粒，將目的基因左右臂及氯霉素抗性基因cat克隆入敲除質(zhì)粒，將敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入金葡菌Newman株，利用同源重組原理以敲除質(zhì)粒的cat基因替換基因組上的目的基因glpD，從而實(shí)現(xiàn)glpD基因的敲除。隨后采用多重引物PCR對敲除株的正確性進(jìn)行了驗(yàn)證。 (3) glpD基因缺失對金葡菌持留性的影響:由于對數(shù)期和穩(wěn)定期細(xì)菌持留菌比例大不相同，故其持留性也有很大差異，所以我們分別在細(xì)菌生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期進(jìn)行持留性實(shí)驗(yàn)。為了選擇最適宜的實(shí)驗(yàn)用抗菌藥物，我們應(yīng)用了多種類別的抗菌藥物進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。最后發(fā)現(xiàn)，對于對數(shù)期持留菌實(shí)驗(yàn)，以環(huán)丙沙星、萬古霉素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以獲得較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果且各實(shí)驗(yàn)組別間差異也較為顯著。而對于穩(wěn)定期持留菌實(shí)驗(yàn)，只有達(dá)托霉素可以實(shí)現(xiàn)對穩(wěn)定期金葡菌較好的殺菌效果，其他抗菌藥物殺菌效力較低，不便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較。故最終我們選定了環(huán)丙沙星、萬古霉素進(jìn)行對數(shù)期持留菌實(shí)驗(yàn)，選定達(dá)托霉素進(jìn)行穩(wěn)定期持留菌實(shí)驗(yàn)。在對數(shù)期持留性實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)以20MIC環(huán)丙沙星作用于菌液8h，glpD敲除株的持留性較野生株增加了約10倍；以20MIC萬古霉素作用8h，glpD敲除株的持留性較野生株增加了約20-40倍，而以100MIC萬古霉素作用8h，二者的持留性差異更顯著，glpD敲除株的持留性較野生株增加了約40-100倍。在穩(wěn)定期持留性實(shí)驗(yàn)中，我們以100MIC達(dá)托霉素作用于穩(wěn)定期野生株和glpD敲除株8h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)glpD敲除株的持留性較野生株下降了近1000倍。我們的實(shí)驗(yàn)表明，金葡菌glpD基因的缺失在細(xì)菌生長的對數(shù)期增加了細(xì)菌的持留性，而在穩(wěn)定期反而降低了細(xì)菌的持留性，且降低的幅度較大。 綜上所述，我們成功構(gòu)建了金葡菌Newman株Tn917轉(zhuǎn)座子插入突變文庫，并證實(shí)文庫具有良好的應(yīng)用價(jià)值。從構(gòu)建的文庫中，我們篩選到了持留性突變菌株，并首次發(fā)現(xiàn)pyrD基因與金葡菌持留性相關(guān)。同時(shí)我們還利用該文庫篩選到一株達(dá)托霉素耐藥突變株，并發(fā)現(xiàn)其耐藥機(jī)制可能與acuAC轉(zhuǎn)錄單位相關(guān)，可能是達(dá)托霉素耐藥的一種新機(jī)制，也表明文庫的建立不僅可以用于篩選持留突變株，更可廣泛用于其他研究。另一方面，我們通過構(gòu)建glpD敲除株首次闡釋了glpD基因?qū)τ诮鹌暇至粜缘淖饔�，�?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示glpD基因在對數(shù)期降低金葡菌的持留性，而在穩(wěn)定期增強(qiáng)金葡菌的持留性。一個(gè)基因可以在細(xì)菌生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期呈現(xiàn)出相反的持留性調(diào)節(jié)作用，這是首次發(fā)現(xiàn)。以上研究結(jié)果拓展了我們對金葡菌持留菌的認(rèn)識與理解。
【關(guān)鍵詞】：持留菌 持留性 金黃色葡萄球菌 轉(zhuǎn)座子文庫 基因敲除 glpD基因
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-20
• 1.1 選題緣由16
• 1.2 研究背景16-18
• 1.3 研究內(nèi)容與方法18-19
• 1.4 研究意義19-20
• 第二章 金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座子突變文庫構(gòu)建與應(yīng)用20-60
• 2.1 金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座子突變文庫的構(gòu)建20-34
• 2.1.1 試劑與材料20-24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 2.1.3 結(jié)果30-32
• 2.1.4 討論32-34
• 2.2 利用轉(zhuǎn)座子文庫進(jìn)行持留性突變菌株研究34-48
• 2.2.1 試劑與材料34-35
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-39
• 2.2.3 結(jié)果39-46
• 2.2.4 討論46-48
• 2.3 利用轉(zhuǎn)座子文庫篩選獲得達(dá)托霉素耐藥菌株48-60
• 2.3.1 試劑與材料48-49
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法49-53
• 2.3.3 結(jié)果53-58
• 2.3.4 討論58-60
• 第三章 金黃色葡萄球菌 glpD 基因與細(xì)菌持留性關(guān)系研究60-85
• 3.1 glpD 與細(xì)菌持留性關(guān)系的研究現(xiàn)狀61-64
• 3.2 glpD 基因敲除突變株的構(gòu)建64-76
• 3.2.1 試劑與材料64-66
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法66-72
• 3.2.3 結(jié)果72-76
• 3.2.4 討論76
• 3.3 glpD 基因缺失對金葡菌持留性的影響76-85
• 3.3.1 試劑與材料77
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)方法77-79
• 3.3.3 結(jié)果79-82
• 3.3.4 討論82-85
• 全文總結(jié)85-86
• 參考文獻(xiàn)86-89
• 文獻(xiàn)綜述一 問題驅(qū)動(dòng)發(fā)展——在疑問中不斷前行的持留菌研究89-98
• 參考文獻(xiàn)96-98
• 文獻(xiàn)綜述二 持留菌研究方法的新進(jìn)展98-107
• 參考文獻(xiàn)105-107
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況107-108
• 致謝108

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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本文編號：969756