本文關鍵詞：全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv中和抗體制備及活性鑒定

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患疾病，幾乎遍及全世界各個國家�？袢∫坏┌l(fā)病尚無有效治療措施，，死亡率幾乎為100%[1]。由于狂犬病的傳染源廣泛存在，全球每年死于狂犬病的人數超過5.5萬人，并且每年至少有1650萬人需要接受狂犬病病毒暴露后治療，疾病控制難度很大。我國是受狂犬病危害最為嚴重的國家之一，僅次于印度，居全球第二位。據保守估計，我國每年超過3000人死于狂犬病，并且近幾年發(fā)病率呈現逐年上升的趨勢。因此研制有效的狂犬病防治藥物具有重要意義[2]。 世界衛(wèi)生組織（WHO）建議，對狂犬病的III級暴露及免疫力低下患者的II級暴露治療，必須立即接種狂犬病疫苗和抗狂犬病病毒免疫球蛋白（RIG）。目前，臨床上使用的RIG包括馬抗狂犬病病毒免疫球蛋白（ERIG）和人抗狂犬病病毒免疫球蛋白（HRIG）兩類。ERIG易引起過敏反應和血清病；HRIG成本高且產量少，存在潛在病毒污染的危險；血源產品質量難以控制，臨床使用存在安全隱患，難以滿足臨床用藥需求，其治療效果也有待于提高[3,4]。因此，研發(fā)全人源基因工程抗體替代傳統(tǒng)的血源性免疫球蛋白已迫在眉睫。 本研究應用噬菌體抗體庫技術，構建抗狂犬病病毒scFv噬菌體抗體庫，從中富集、篩選具有中和活性的全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗體，為研制可用于人狂犬病病毒暴露后的緊急預防藥物奠定基礎。 研究方法 1.構建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌體抗體庫 取130位經狂犬病疫苗免疫志愿者的外周血淋巴細胞，提取總RNA，逆轉錄制備cDNA；用人源特異性抗體引物擴增VH、VL基因，再經過重疊PCR制備scFv基因片斷；將scFv片斷與pComb3XSS同時經SfiI酶切、純化并連接后電轉化入宿主菌E.coli.XL1-Blue，加入輔助噬菌體VCSM13過夜培養(yǎng)后，上清經PEG8000/NaCl沉淀，構建抗狂犬病病毒scFv噬菌體抗體庫。 2. E.coli.TOP10F′原核表達系統(tǒng)表達并純化狂犬病病毒G蛋白（RVG） 以逆轉錄制備的cDNA為模板，擴增RVG基因，PCR產物膠回收純化，經酶切與重組質粒pColdⅡ連接，連接產物測序正確后進一步轉化E.coli.TOP10F′感受態(tài)細胞，IPTG誘導表達，Western Blot鑒定，His-Trap HP鎳親和柱純化狂犬病病毒G蛋白，SDS-PAGE電泳及質譜鑒定。 3.抗狂犬病病毒G蛋白特異性scFv抗體的篩選、表達及中和活性鑒定 以純化的狂犬病病毒G蛋白包被ELISA板，將構建的抗體庫進行“吸附-洗脫-富集”，從篩選得到的細菌集落中隨機挑選單克隆，phage-ELISA鑒定。陽性克隆經序列分析后，進行表達、純化和結合活性的初步鑒定；ELISA、熒光抗體中和試驗等對表達產物進行生物學活性鑒定。 研究結果 1.構建全人源抗狂犬病病毒噬菌體抗體庫：采用噬菌體展示技術，經over-lap PCR擴增得到scFv基因片段約750bp，電轉化導入E.coli.XL1-Blue中，構建了庫容為5.0107的全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌體抗體庫。 2.狂犬病病毒G蛋白的表達：根據GenBank收錄的狂犬病病毒G蛋白基因序列，設計特異性引物，以cDNA為模板擴增出RVG基因片段，擴增片段大小為1500bp，與預期相符；將擴增產物純化與載體質粒pColdⅡ酶切后連接測序，測序正確后，轉化E.coli.TOP10F′感受態(tài)細胞，誘導表達，Western Blot鑒定表明為目的蛋白，SDS-PAGE電泳顯示純化后蛋白分子量大小67KD。質譜鑒定結果證明所表達的蛋白為狂犬病病毒G蛋白（rabies virus strain CTN glycoproteinGI:11528007）。 3.抗狂犬病病毒G蛋白特異性scFv抗體的篩選及表達：以純化的狂犬病病毒G蛋白為抗原進行了五輪富集篩選，從全人源scFv噬菌體抗體庫中篩選抗狂犬病病毒抗體，每一輪篩選后噬菌體抗體收獲率均有增加，第五輪篩選的噬菌體抗體收獲率較第一輪提高了20倍；共獲得4株核酸序列不同的scFv抗體，分別為scFv28、scFv70、scFv44、scFv42，初步檢測后進行表達，純化。 4.抗狂犬病病毒G蛋白特異性scFv抗體生物學活性鑒定：通過ELISA等方法對篩選出的抗體進行初步生物學活性分析，結果表明，4株scFv抗體均可與狂犬病病毒及G蛋白特異性結合；抗體中和試驗結果證實，scFv42具有中和活性。 研究結論 1.成功構建了全人源抗狂犬病病毒噬菌體抗體庫，庫容為5.0107，為制備抗狂犬病病毒抗體奠定了基礎。 2.通過原核表達體系表達并純化了狂犬病病毒G蛋白，為篩選全人源抗狂犬病病毒G蛋白抗體提供了抗原。 3.篩選獲得4株抗狂犬病病毒抗體，證明其中一株抗體scFv42具有中和活性，具有替代目前血源性免疫球蛋白用于狂犬病病毒暴露后治療的潛能。
【關鍵詞】：狂犬病病毒糖蛋白 免疫型噬菌體抗體庫 噬菌體抗體 單鏈抗體 中和抗體
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.9;R392
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 研究一 全人源抗狂犬病病毒 scFv 噬菌體抗體庫的構建14-31
• 摘要14
• 材料與方法14-26
• 結果26-29
• 討論29-31
• 研究二 狂犬病病毒 G 蛋白表達、純化及鑒定31-43
• 摘要31
• 材料與方法31-38
• 結果38-41
• 討論41-43
• 研究三 抗狂犬病病毒 G 蛋白 scFv 抗體的篩選、表達及中和活性鑒定43-57
• 摘要43
• 材料與方法43-51
• 結果51-54
• 討論54-57
• 小結57-58
• 參考文獻58-61
• 附錄一：scFv 基因序列61-64
• 附錄二：文獻綜述64-78
• 參考文獻73-78
• 附錄三：縮略語78-79
• 附錄四：在讀期間發(fā)表的論文和參與的科研工作79-80
• 致謝80

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前5條

1 張曉;曾曉燕;劉哲;金秋;徐言;馮振卿;焦永軍;;H5N1型禽流感病毒廣譜中和單克隆抗體的篩選及其中和機制初步研究[J];生物化學與生物物理進展;2011年06期

2 馬小兵;暢繼武;;噬菌體抗體庫技術[J];生物學通報;2005年10期

3 梁秀梅，于潛;狂犬病病毒和狂犬病[J];生物學通報;1994年06期

4 閉蘭,張愛華,彭祥兵,王志友,張智,余模松;從半合成噬菌體抗體庫篩選抗狂犬病毒人單鏈抗體[J];中國生物制品學雜志;2004年02期

5 王曉虎;靳玉珠;丁壯;扈榮良;;治療性狂犬病病毒單克隆抗體的研究進展[J];中國生物制品學雜志;2009年10期

本文編號：969067