本文關(guān)鍵詞：ANKIB1單克隆抗體的制備和ANKIB1表達(dá)分析

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【摘要】：目的 1、制備抗人ANKIB1的小鼠單克隆抗體。 2、分析ANKIB1在人類細(xì)胞系和腦組織中的表達(dá)情況。 方法 在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)GST-ANKIB1(1-480)重組蛋白。利用谷胱甘肽瓊脂糖4B柱親和層析純化GST-ANKIB1(1-480),以純化蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠,利用雜交瘤技術(shù)建立可分泌抗人ANKIB1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。按常規(guī)方法制備腹水,分別利用抗體純化試劑盒和抗體分型試劑盒純化抗體并鑒定抗體的亞類,分別運(yùn)用Western blotting、免疫沉淀、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證抗ANKIB1抗體的生物學(xué)用途,并分析ANKIB1在多種人類細(xì)胞系中的表達(dá)、細(xì)胞定位及其在人(鼠)腦中的表達(dá)情況。 在大腸桿菌BL21(DE3)中分別表達(dá)GST和GST-ANKIB1蛋白,使用谷胱甘肽瓊脂糖4B柱分別純化GST和GST-ANKIB1蛋白,將人胎腦蛋白溶液先與結(jié)合了GST的谷胱甘肽瓊脂糖4B柱混合,從中清除GST相互作用蛋白,然后利用已結(jié)合GST-ANKIB1的谷胱甘肽瓊脂糖4B柱從經(jīng)過預(yù)清除的腦蛋白溶液中富集ANKIB1相互作用蛋白。 使用Protein G-小鼠IgG親和層析柱從人胎腦蛋白中預(yù)清除與小鼠IgG相互作用的蛋白,然后利用Protein G-ANKIB1抗體親和層析柱從經(jīng)過預(yù)清除的腦蛋白中富集與ANKIB1相互作用的蛋白。 結(jié)果 1、獲得了兩株能夠穩(wěn)定分泌ANKIB1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F9和7A9,所分泌抗體能夠識別人、大鼠、小鼠的ANKIB1。 2、ANKIB1單克隆抗體可以運(yùn)用于ELISA、Western blotting、免疫沉淀、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 3、ANKIB1在人類不同細(xì)胞系中均有表達(dá),主要以122kDa和95kDa兩種分子量的蛋白為主,其中前者與我們預(yù)測的理論分子量相一致,表達(dá)水平明顯比后者高,后者可能是ANKIB1蛋白的一種亞型。 4. ANKIB1在HEK293細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布,但細(xì)胞核中水平較高。 5、利用GST沉降和免疫共沉淀技術(shù)從人胎腦中富集到了ANKIB1相互作用蛋白。 結(jié)論 成功制備了ANKIB1單克隆抗體,該抗體可以應(yīng)用于ELISA、Western blotting、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)。ANKIB1在人類不同細(xì)胞系和腦組織中廣泛表達(dá),但表達(dá)方式和表達(dá)水平有明顯差異。ANKIB1在HEK293全細(xì)胞中均有分布,在細(xì)胞核中的表達(dá)水平高于細(xì)胞質(zhì)。從人胎腦蛋白中純化出了大量ANKIB1相互作用蛋白,為研究ANKIB1的功能和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：ANKIB1 單克隆抗體 表達(dá) 細(xì)胞定位 蛋白相互作用
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 1 材料和方法11-25
• 1.1 材料11-15
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及胚胎11
• 1.1.2 菌株和細(xì)胞株11-12
• 1.1.3 試劑12
• 1.1.4 質(zhì)粒載體及引物12-13
• 1.1.5 抗體13
• 1.1.6 試劑盒13
• 1.1.7 主要耗材13-14
• 1.1.8 主要緩沖液14
• 1.1.9 主要儀器設(shè)備14-15
• 1.2 方法15-25
• 1.2.1 ANKIB1單克隆抗體的制備15-19
• 1.2.2 ANKIB1的內(nèi)源性表達(dá)和定位19-21
• 1.2.3 ANKIB1相互作用蛋白的篩選21-25
• 2 結(jié)果25-40
• 2.1 單克隆抗體的制備25-33
• 2.1.1 抗原的表達(dá)和純化25
• 2.1.2 免疫小鼠血清效價的測定25-26
• 2.1.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選和鑒定26-29
• 2.1.4 單克隆抗體的純化及鑒定29-33
• 2.2 ANKIB1的內(nèi)源性表達(dá)和定位33-37
• 2.2.1 ANKIB1在人類不同細(xì)胞系的表達(dá)33-34
• 2.2.2 ANKIB1在HEK293細(xì)胞中的分布34-37
• 2.3 ANKIB1相互作用蛋白的篩選37-40
• 2.3.1 pull down篩選ANKIB1相互作用蛋白37
• 2.3.2 Co-IP篩選ANKIB1相互作用蛋白37-40
• 3 討論40-43
• 4 結(jié)論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 附圖161-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況62-63
• 致謝63-64
• 個人簡歷64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：960914