本文關(guān)鍵詞：E3泛素連接酶FBW7在血管新生中的功能研究

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【摘要】：“泛素-蛋白酶體”體系介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程與人體許多重要生理和病理過程密切相關(guān)。在正常細(xì)胞中,如果某些原癌基因發(fā)生突變,可能導(dǎo)致其相應(yīng)原癌蛋白的降解過程發(fā)生障礙,從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的發(fā)生；在腫瘤細(xì)胞中,如果某些腫瘤抑制因子發(fā)生突變或者被過度降解,使其腫瘤抑制活性大大降低,從而促進(jìn)腫瘤的生長并加速病情的惡化�！胺核�-蛋白酶體”體系介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化降解過程廣泛地參與調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程,對細(xì)胞的生命活動具有重要而深刻的影響�！胺核�-蛋白酶體”體系介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化降解一直以來是分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 “泛素-蛋白酶體”降解體系的主要成分有：泛素、泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體等。各種成分通過有序的級聯(lián)催化反應(yīng)最終特異性介導(dǎo)底物蛋白的泛素化修飾,最終在26S蛋白酶體的催化作用下降解,該過程需要ATP提供能量�！胺核�-蛋白酶體”體系對細(xì)胞生命活動的調(diào)控具有“廣泛性”和“精確性”雙重特征�！皬V泛性”體現(xiàn)在“泛素-蛋白酶體”途徑幾乎介導(dǎo)體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的降解,幾乎參與調(diào)控細(xì)胞生命活動的各個方面�！熬_性”體現(xiàn)在“泛素-蛋白酶體”對底物蛋白的高度選擇性和特異性。E3泛素連接酶是保證“泛素-蛋白酶體”體系特異性識別并降解底物蛋白的關(guān)鍵組分。在目前發(fā)現(xiàn)的大約600多種E3泛素連接酶中,FBW7是近些年來備受關(guān)注的明星分子之一。 FBW7的英文全稱為"F-box and WD repeat domain-containing7",它是F-box蛋白家族的成員之一。FBW7屬于SCF型E3泛素連接酶,由SKP1、CUL1、RBX1和F-box四種蛋白構(gòu)成,通過結(jié)構(gòu)域之間的相互作用結(jié)合在一起,以蛋白復(fù)合物的形式發(fā)揮E3泛素連接酶功能。在FBW7調(diào)控的眾多底物蛋白中,有些是被廣泛研究的原癌蛋白,如MYC、KLF5等；有些參與細(xì)胞周期調(diào)控,如cyclinE等；有些則是某些信號通路的轉(zhuǎn)錄因子,如Notch、Jun等。由于FBW7的許多降解底物都與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),FBW7是公認(rèn)的極其重要的腫瘤抑制因子。大量研究表明,在許多腫瘤細(xì)胞中FBW7發(fā)生了基因突變,這直接導(dǎo)致FBW7腫瘤抑制因子功能的喪失。根據(jù)文獻(xiàn)報道,FBW7基因敲除型小鼠在胚胎發(fā)育E10.5天前后致死,這可能與其血管和造血系統(tǒng)發(fā)育存在嚴(yán)重缺陷密切相關(guān)。美國密歇根大學(xué)Sun Yi教授的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),與FBW7具有高度相似性的SCF家族E3泛素連接酶SAG/RBX2/ROC2在小鼠血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。然而人們目前對于FBW7在血管系統(tǒng)發(fā)育中的調(diào)控作用知之甚少,這個問題激發(fā)了我們以極大的研究熱情去探索FBW7在血管生物學(xué)中的作用。 “血管發(fā)生”和“血管新生”是血管系統(tǒng)發(fā)育過程中兩個既相互獨(dú)立又密切相關(guān)的概念和現(xiàn)象。前者是指在胚胎發(fā)育過程中,起源于中胚層的部分細(xì)胞特化為“血-血管干細(xì)胞”,這些細(xì)胞進(jìn)而聚集形成團(tuán)狀,被稱為“血島”。血島的外部細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為成血管細(xì)胞,成血管細(xì)胞最終分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞在某些信號因子刺激下,生長遷移形成細(xì)長的管狀結(jié)構(gòu),它們相互交織并連接成為網(wǎng)絡(luò),形成初級毛細(xì)血管叢。初級毛細(xì)血管叢最終分化為靜脈、動脈和毛細(xì)血管等成熟的血管系統(tǒng),此過程稱為“血管發(fā)生”。血管新生則是在某些環(huán)境因素或者信號刺激下,已存在血管內(nèi)皮細(xì)胞增值分裂、遷移萌發(fā)形成細(xì)微幼稚新生血管的過程。由此可見,“血管發(fā)生”是從“源頭”開始的,是從“無”到“有”的發(fā)育過程；“血管新生”是在己有血管基礎(chǔ)上,從“舊”到“新”的過程,這是兩者的不同之處。 本論文的主要內(nèi)容分為以下幾部分進(jìn)行論述： 一、FBW7在小鼠主要臟器的血管內(nèi)皮中呈高表達(dá)。 免疫組織化學(xué)染色表明FBW7在小鼠肝臟、心臟、腎臟等組織的血管內(nèi)皮中呈顯著表達(dá)。同時我們利用RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)一步證明了在以上血管豐富的臟器中FBW7的表達(dá)量豐富。這提示我們FBW7可能在血管生物學(xué)中發(fā)揮作用。 二、FBW7蛋白表達(dá)量下調(diào)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力以及血管新生活性。 “內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)”是檢驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生活性的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。用siRNA下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs中FBW7的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力和血管新生活性均受到顯著抑制。 三、FBW7蛋白表達(dá)量下調(diào)抑制生理性和病理性血管新生。 “小鼠角膜微囊袋實(shí)驗(yàn)”和‘'Matrigel Plug實(shí)驗(yàn)”表明,在血管內(nèi)皮生長因子VEGF誘導(dǎo)下,FBW7可以調(diào)控基質(zhì)膠中新生血管的萌發(fā),也可調(diào)控小鼠角膜區(qū)域的血管新生。 四、FBW7蛋白表達(dá)量下調(diào)抑制畸胎瘤生長和畸胎瘤內(nèi)部的血管發(fā)育。 我們構(gòu)建了強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)shRNA表達(dá)的慢病毒載體,當(dāng)我們用該慢病毒感染小鼠胚胎干細(xì)胞,在強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)下,沉默畸胎瘤細(xì)胞中FBW7的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)FBW7表達(dá)量下調(diào)抑制了畸胎瘤的生長以及畸胎瘤內(nèi)部的血管發(fā)生。 五、FBW7影響血管新生的分子機(jī)制。 血管新生是指在已有血管系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,從己存在血管內(nèi)皮細(xì)胞萌發(fā)重建并形成新血管的過程。FBW7對血管新生的調(diào)控是基于對內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。我們通過泛素化降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FBW7可以特異地泛素化降解在內(nèi)皮細(xì)胞中起重要調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子“KLF2”。KLF2廣泛參與調(diào)控包括血管新生、血管張力、血栓形成等多種內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能。據(jù)文獻(xiàn)報道,內(nèi)皮細(xì)胞中KLF2蛋白上調(diào)可以抑制VEGFR2的表達(dá),進(jìn)而抑制血管新生活性。我們在"Matrigel Plug實(shí)驗(yàn)”和“畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)”中同時下調(diào)FBW7和KLF2,發(fā)現(xiàn)FBW7對血管新生、畸胎瘤生長、血管發(fā)生等的抑制效應(yīng)被顯著地逆轉(zhuǎn)。因此我們認(rèn)為FBW7通過泛素化降解KLF2來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶FBW7參與對生理性和病理性血管新生的調(diào)控。FBW7通過泛素化降解KLF2這一血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子,從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,并參與調(diào)控生理性和病理性血管新生。
【關(guān)鍵詞】：泛素-蛋白酶體 蛋白質(zhì)降解 血管新生 FBW7 KLF2
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 第一章 研究背景和文獻(xiàn)綜述15-27
• 一、“泛素-蛋白酶體”介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程15-18
• 二、E3泛素連接酶FBW7的研究進(jìn)展18-22
• 三、生理性和病理性血管新生的調(diào)控22-25
• 四、轉(zhuǎn)錄因子KLF2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)控功能25-27
• 第二章 論文的研究目的和意義27-28
• 第三章 實(shí)驗(yàn)材料、試劑、耗材和儀器28-37
• 一、實(shí)驗(yàn)材料28-30
• 二、實(shí)驗(yàn)試劑30-35
• 三、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備35-36
• 四、實(shí)驗(yàn)耗材36-37
• 第四章 實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)操作37-53
• 一、動物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作37-46
• 二、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)46-49
• 三、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)49-53
• 第五章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析53-75
• 第一節(jié) FBW7在血管內(nèi)皮中的表達(dá)53-55
• 第二節(jié) FBW7對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成能力的影響55-57
• 第三節(jié) FBW7對生理性和病理性血管新生的影響57-60
• 第四節(jié) FBW7對畸胎瘤生長和血管發(fā)生的影響60-62
• 第五節(jié) FBW7影響生理性和病理性血管新生的分子機(jī)制62-68
• 第六節(jié) KLF2對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成能力的影響68-70
• 第七節(jié) KLF2對血管新生活性的影響70-71
• 第八節(jié) KLF2對畸胎瘤生長和血管生成的影響71-74
• 第九節(jié) FBW7通過泛素化降解KLF2調(diào)節(jié)血管新生的模型74-75
• 第六章 論文的總結(jié)與討論75-77
• 第七章 攻讀碩士期間的其他工作77-92
• 一、IHC染色在研究抗原細(xì)胞定位和抗原表達(dá)量相關(guān)性中的應(yīng)用77-82
• 二、兔抗血清的制備82-86
• 三、SCP1轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定86-92
• 附錄：縮略語簡表92-95
• 參考文獻(xiàn)95-99
• 致謝99-100

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉新蘭;李亦功;魏建敏;趙艷嬌;;Ang-2、Tie-2和VEGFR-2表達(dá)在大腸癌血管生成和預(yù)后中的作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年11期

2 Yoko Matsuda;Masahito Hagio;Toshiyuki Ishiwata;;Nestin:A novel angiogenesis marker and possible target for tumor angiogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2013年01期

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本文編號：945895