本文關(guān)鍵詞：血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞自噬的影響及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 血管緊張素II 足細(xì)胞 自噬 Rho激酶 3-甲基腺嘌呤 法舒地爾

【摘要】：研究背景與目的 足細(xì)胞(podocyte)作為一種終末高度分化細(xì)胞，是維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障(glomerularfiltration barrier，GFB)的最關(guān)鍵部分，對(duì)防止血漿白蛋白和大分子蛋白的濾過(guò)起重要作用。足細(xì)胞的損傷和丟失是導(dǎo)致腎臟疾病發(fā)展和腎功能衰竭的主要因素。 自噬(autophagy)是存在于酵母至人類等真核生物細(xì)胞中的一種高度保守的、維持細(xì)胞自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要胞內(nèi)降解機(jī)制，通過(guò)溶酶體蛋白降解途徑清除受損的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)，以“垃圾處理廠”及“廢品回收站”的方式為蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞器的更新提供原料，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞的完整性。作為一種終末高度分化細(xì)胞，足細(xì)胞的存活主要依賴于自噬吞噬體有效的清除不需要和損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞正常生命活動(dòng)，但過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生“自噬性程序性死亡”。定位在前自噬體和自噬體膜表面的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-Associated Protein1Light Chain3，LC3)參與了自噬體的形成，是目前檢測(cè)自噬水平的特異性標(biāo)記物。LC3以LC3-I和LC3-II兩種形式存在于細(xì)胞中，發(fā)生自噬時(shí)以細(xì)胞溶質(zhì)形式存在的LC3-I經(jīng)包含Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣修飾加工后，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)結(jié)合，LC3-I即轉(zhuǎn)化為分子量較小的LC3-II并結(jié)合在自噬體膜上。Beclin-1是一種與自噬相關(guān)的抑癌基因，與酵母自噬基因Atg6同源，通過(guò)與III型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinaseclass III，PI3KC3)結(jié)合形成PI3K復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)自噬體的形成。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem，RAS)在腎臟疾病的病理生理進(jìn)程中起重要作用，血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)作為RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，可通過(guò)與細(xì)胞上的血管緊張素受體(angiotensin receptor, ATR)作用，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在腎臟的局部濃度比系統(tǒng)水平高出60～100倍,，說(shuō)明AngII對(duì)腎臟細(xì)胞的直接生物學(xué)效應(yīng)可能更為關(guān)鍵。 Rho激酶又稱為Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associated kinase，ROCKs)，是Rho家族小G蛋白成員RhoA下游最主要、最具特征性的信號(hào)分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子能激活Rho激酶信號(hào)通路，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血小板源性生長(zhǎng)因子(plateletderived growth factor，PDGE)、白介素1(interleukin-1，IL-1)、內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)等。研究證實(shí)Rho激酶信號(hào)途徑也可以通過(guò)AngII激活，但其具體機(jī)制仍然不清。Rho激酶途徑具有調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、遷移、增生、凋亡等功能,在多種腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。法舒地爾(fasudil)作為Rho激酶抑制劑，在腎臟損傷中的保護(hù)作用被廣泛的證實(shí)，如能阻止TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞分化成成纖維細(xì)胞，防止小管間質(zhì)發(fā)生纖維化；通過(guò)抑制Rho激酶信號(hào)途徑，降低炎癥因子和細(xì)胞因子的分泌，減輕氧化應(yīng)激和蛋白尿，及改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)來(lái)延緩糖尿病腎病的進(jìn)展等。目前研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶通路在調(diào)節(jié)自噬中起重要作用，Aditi等研究發(fā)現(xiàn)激活Rho激酶通路，使Beclin-1BH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致Beclin-1-Bcl-2多聚蛋白復(fù)合體解離，，而不影響UVRAG-Beclin-1復(fù)合體的相互作用和增加Beclin-1和Vps34的相互作用，從而引起自噬發(fā)生；Yunbo chen等研究發(fā)現(xiàn)Aβ活化物能上調(diào)ROCK表達(dá)而激活自噬。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的特殊抑制劑，通過(guò)抑制Beclin-1-PI3KC3復(fù)合物的形成，而抑制自噬活性。目前研究顯示Rho激酶途徑活化與PI3K/AKT通路的活化相關(guān)。結(jié)合ROCKs抑制劑法舒地爾對(duì)慢性腎臟病的保護(hù)作用。本研究擬采用AngII體外刺激足細(xì)胞，觀察足細(xì)胞的自噬情況，并通過(guò)法舒地爾和3-MA干預(yù)此過(guò)程，初步探討Ang II誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬的可能機(jī)制，為腎臟疾病的治療的提供新思路。 實(shí)驗(yàn)方法 1.人永生化足細(xì)胞(AB8/13)的復(fù)蘇及培養(yǎng)，在33℃、5%CO2中增值，在37℃、5%CO2中分化成熟后實(shí)驗(yàn)。 2.體外采用不同濃度AngII(10-8~10-6mol/l)刺激足細(xì)胞24h及固定濃度刺激足細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h、36h)后，Western blot檢測(cè)足細(xì)胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。 3.將足細(xì)胞(AB8/13)進(jìn)行細(xì)胞爬片，用PI3K抑制劑3-MA (5mM)和Rho激酶抑制劑法舒地爾(10-7mol/l)預(yù)處理30min，AngII刺激足細(xì)胞24h后以免疫熒光法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)及分布情況。 4.不同法舒地爾濃度(10-8~10-6mol/l)預(yù)處理足細(xì)胞30min，AngII刺激足細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)足細(xì)胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 1.不同濃度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)LC3-II的蛋白表達(dá)，隨著劑量的增加，LC3-II的蛋白表達(dá)增加，在濃度為10-7mol/l時(shí)達(dá)到峰值。 2.固定濃度(10-7mol/l)AngII刺激足細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h、36h)，Westernblot檢測(cè)LC3-II的蛋白表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3-II的蛋白表達(dá)增加，在24h達(dá)到峰值，后呈下降趨勢(shì)。 3.不同濃度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)Beclin-1的蛋白表達(dá)，隨著劑量的增加，Beclin-1的蛋白表達(dá)增加，在濃度為10-7mol/l時(shí)達(dá)到峰值。 4.固定濃度(10-7mol/l)AngII刺激足細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h、36h)，Westernblot檢測(cè)Beclin-1的蛋白表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Beclin-1的蛋白表達(dá)增加，在24h達(dá)到峰值，后呈下降趨勢(shì)。 5.3-MA抑制AngII誘導(dǎo)的足細(xì)胞LC3的表達(dá)，并抑制其向細(xì)胞核周圍聚集。 6.法舒地爾單獨(dú)不影響足細(xì)胞LC3-II和Beclin-1的蛋白表達(dá)，但能降低AngII引起的LC3-II和Beclin-1的表達(dá)，并呈一定的濃度依賴，法舒地爾濃度為10-7mol/l時(shí)抑制作用最強(qiáng)。 7.免疫熒光檢測(cè)單獨(dú)法舒地爾不影響LC3的表達(dá)，但能抑制AngII誘導(dǎo)的足細(xì)胞LC3的表達(dá)及向細(xì)胞核周圍聚集。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AngII可以促進(jìn)人足細(xì)胞發(fā)生自噬，并呈一定的濃度時(shí)間依賴，而PI3K抑制劑3-MA和Rho激酶抑制劑法舒地爾可以抑制AngII誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬，可能與AngII激活Rho激酶通路相關(guān)，通過(guò)抑制Rho激酶信號(hào)途徑，可能成為治療局部RAS系統(tǒng)激活導(dǎo)致腎損害的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：血管緊張素II 足細(xì)胞 自噬 Rho激酶 3-甲基腺嘌呤 法舒地爾
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 血管緊張素 II 對(duì)足細(xì)胞自噬的影響16-29
• 2.1 引言16
• 2.2 材料與方法16-22
• 2.3 結(jié)果22-26
• 2.4 討論26-28
• 2.5 小結(jié)28-29
• 第三章 Rho 激酶抑制劑法舒地爾對(duì)血管緊張素 II 誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬的影響29-39
• 3.1 引言29
• 3.2 材料與方法29-33
• 3.3 結(jié)果33-36
• 3.4 討論36-38
• 3.5 小結(jié)38-39
• 全文結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 文獻(xiàn)綜述 自噬與足細(xì)胞損傷的研究進(jìn)展45-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 武多嬌;張怡;高平進(jìn);朱鼎良;;法舒地爾抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及其機(jī)制[J];中國(guó)臨床藥學(xué)雜志;2010年02期

本文編號(hào)：943809