本文關(guān)鍵詞：改良富血小板血漿對人骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖及礦化作用的實驗研究

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【摘要】：背景和目的 1993年Hood等首先提出了富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)的概念[l],PRP是通過離心全血后得到的血小板濃縮物,含有高濃度生長因子。不同于原來造價昂貴、使用劑量高、有效期限短且無法有效傳遞至目標細胞的重組人類生長因子,作為一種自體生物材料,PRP具有制備簡單、易于操作、價格低廉、生物安全性高、并發(fā)癥(如疾病傳播和免疫反應(yīng))少等優(yōu)點[4],故被廣大研究者和臨床醫(yī)師公認為具有廣闊的應(yīng)用前景。 激活的PRP通過大量生長因子如血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長因子p (TGF-p)等發(fā)揮聯(lián)合或協(xié)同作用,影響成骨細胞的趨化、增殖和分化,促進骨組織的形成和再生,至今PRP已被成功應(yīng)用于頜骨、顱骨和脊柱的骨移植手術(shù)、心血管手術(shù)和相關(guān)的代謝性骨疾病的治療。 在骨組織工程研究中,尋找能充分發(fā)揮組織再生潛力的支架材料和構(gòu)建生物學微觀環(huán)境是研究的核心內(nèi)容。Xie,X等的研究表明：PRP可形成一個網(wǎng)眼樣超微結(jié)構(gòu)組成的3D支架,并能釋放內(nèi)源性生長因子,且迅速與細胞結(jié)合。間充質(zhì)干細胞植于PRP支架后表現(xiàn)出較高的增殖速率、軟骨相關(guān)基因和蛋白的表達。在兔的骨缺損模型中植入含有骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的PRP支架也表現(xiàn)出更好的成軟骨方面的大體和組織學、免疫組織化學特性,成軟骨相關(guān)基因和蛋白的表達增強,且可促進軟骨下的骨組織再生。 在骨的形成和修復(fù)中骨膜通過血管形成和提供骨祖細胞發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Elbackly RM等提出了使用PRP薄膜和自體骨髓來源BMSCs (PRP/BMSCs凝膠薄膜)作為骨膜替代物圍繞著骨引導支架來引導骨缺損的再生,研究發(fā)現(xiàn)PRP/BMSCs凝膠薄膜在體外能夠顯著地誘導人內(nèi)皮細胞的遷移,并且增加人工培養(yǎng)的BMSCs的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達；這些細胞還分泌大量的可溶親血管生成因子如PDGF-BB、VEGF、IL-8等,促進血管的形成。最終,PRP/BMSCs凝膠薄膜作為骨膜替代物在免疫抑制小鼠和兔部分骨缺損動物模型中,均驗證了它在骨膜仿生中發(fā)揮的增強骨再生作用。 劉興文等[8]通過體外觀察PRP對自體BMSCs堿性磷酸酶活性的影響,結(jié)果顯示PRP能促進BMSCs成骨標志物堿性磷酸酶活性,說明PRP能誘導BMSCs向成骨細胞分化,并且提高BMSCs的分化能力。 但是,也有一些反對者認為PRP沒有或很少有正面的促進作用。Aghaloo等[9]在一個對兔顱骨缺損修復(fù)的動物實驗中發(fā)現(xiàn),PRP加入自體骨移植后組織形態(tài)評估顯示僅輕度大于單獨的自體骨移植,并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。一些研究甚至表明PRP起到了負面的抑制作用,PRP在免疫功能不全的老鼠實驗?zāi)Ｐ椭?減少了脫礦骨基質(zhì)的成骨誘導,并且抑制了脫礦骨基質(zhì)的活性。 BMSCs來源于中胚層,具有很強的自我復(fù)制和橫向分化潛能,大量的研究表明,在體外特定的誘導條件下BMSCs可分化為骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、肌肉及肝等多種功能細胞,對間質(zhì)組織如骨、軟骨、肌鍵、脂肪和骨髓基質(zhì)的再生也有重要作用。 Maniatopoulos等首次報道了從成年大鼠的骨髓獲取的BMSCs,在體外培養(yǎng)條件下能形成鈣化的骨樣組織,經(jīng)X線衍射分折,證實鈣化組織具有羥基磷灰石樣結(jié)構(gòu)。實驗表明體外培養(yǎng)BMSCs可以向成骨細胞分化并形成類骨組織。Ouyang等在培養(yǎng)基內(nèi)加入抗壞血酸后發(fā)現(xiàn)BMSCs排列緊密呈片狀生長,將BMSCs片與移植骨片結(jié)合植入受損部位,3周后形態(tài)與組織學結(jié)果表明,植入物的結(jié)構(gòu)與正常骨膜相似,并向成骨分化。國內(nèi)諸多研究也證實BMSCs的體外成骨轉(zhuǎn)化。由于BMSCs免疫原性較弱、培養(yǎng)技術(shù)簡便、體外增殖迅速、且可被冷凍保存,因此它己成為細胞及基因治療研究中的種子細胞,并具有潛在的臨床應(yīng)用價值。 現(xiàn)階段在BMSCs的體外研究中,細胞的體外培養(yǎng)、擴增、分化和凍存等一般都需使用含胎牛血清或小牛血清制品,外源性血清的使用,使得干細胞在骨組織工程及臨床應(yīng)用中存在導致人畜共患疾病傳播的風險。而現(xiàn)有的PRP制備一般需加入外源性物質(zhì)(氯化鈣、人或牛凝血酶等)來激活血小板,以促進大量的生物活性蛋白的產(chǎn)生和釋放,外源性物質(zhì)的加入,使PRP應(yīng)用于臨床及骨組織工程研究中也存在傳染病傳播及免疫排斥的風險。段建民等采用液氮凍融的方式激活血小板,制成改良富血小板血漿(modified platelet-rich plasma,mPRP),實驗研究顯示mPRP對人牙髓細胞、小鼠成骨細胞等的增殖具有明顯促進作用,并且該作用具有濃度依賴性。與傳統(tǒng)的血小板激活方式相比,液氮凍融不僅可以完好保存血小板內(nèi)生長因子和生物活性蛋白的活性,而且可以避免因使用人或動物等外來凝血酶而出現(xiàn)傳染性疾病和免疫排斥反應(yīng)的風險。 本實驗的目的是觀察mPRP對體外培養(yǎng)的人BMSCs增殖及成骨向分化的作用效果,進而為將來使用mPRP替代外源性血清制品,來提高骨組織工程中人BMSCs(種子細胞)體外擴增培養(yǎng)的生物安全性提供實驗依據(jù)。 方法 1.mPRP的制備 從提供骨髓的志愿者肘靜脈采集血小板,二次離心法分離獲得PRP,全血細胞分析儀進行血小板計數(shù)后,將PRP分裝入凍存管內(nèi),液氮反復(fù)凍融3次激活后離心,吸取上清液過濾用于實驗。 2.人BMSCs的分離和培養(yǎng) 抽取健康志愿者骨髓血5mL,密度梯度離心法分離人BMSCs,連續(xù)3代傳代純化培養(yǎng)。 3.人BMSCs的鑒定 取第三代人BMSCs,以1×105個／孔的密度接種于6孔板中,待細胞進入對數(shù)生長期后分別換為成脂誘導液和礦化誘導液,于誘導第14d、21d后分別進行油紅O染色和茜素紅染色。 取人BMSCs懸液行流式細胞術(shù)檢測細胞表面抗原CD44、CD105、CD34、 STRO-1。 4.mPRP對人BMSCs增殖的作用 取生長良好的人BMSCs,接種至96孔板,分別加入含2%、5%、10%、20%mPRP的a-MEM培養(yǎng)液,含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液作為對照,隔天每組取4孔,CCK-8法測定,以時間為橫軸,OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。 5.mPRP對人BMSCs礦化的作用 取第三代人BMSCs,于不同濃度mPRP礦化誘導液中培養(yǎng)7d,按堿性磷酸酶(ALP)試劑盒要求測定ALP活性；不同濃度mPRP礦化誘導液培養(yǎng)21d后,茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。 6.mPRP對人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA表達的作用 實時熒光定量PCR (RT-PCR)測定以不同濃度mPRP礦化培養(yǎng)液培養(yǎng)7d的人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA的相對表達量。 7.統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析,結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示,P0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果 1.PRP血小板計數(shù) 全血中血小板濃度為187×109L-1, PRP中血小板濃度為1001×109L-1,約為全血濃度的5.4倍。 2.人BMSCs的生長和純化 人BMSCs培養(yǎng)48h后可見少量細胞貼壁,細胞呈梭形,培養(yǎng)10d后細胞增生為成纖維樣,有少許不規(guī)則突觸,呈團簇狀生長。約2周后細胞達到80%左右融合,連續(xù)培養(yǎng)至第3代時細胞形態(tài)較均一,呈長梭形,胞核居中。 3.人BMSCs的鑒定結(jié)果 人BMSCs經(jīng)成脂誘導2周后油紅O染色可見胞漿內(nèi)含有橙紅色融合脂滴；經(jīng)成骨誘導3周后,茜素紅染色可見紅色礦化結(jié)節(jié)形成。 人BMSCs中CD44、CD105和STOR-1表達為陽性,而CD34表達為陰性,符合人BMSCs表面標記物一般表型。 4.mPRP對人BMSCs增殖的作用 在不同濃度mPRP培養(yǎng)液培養(yǎng)下,人BMSCs于第4d進入對數(shù)生長期,5%-10%的mPRP組與對照組(10%FBS組)相比較,在培養(yǎng)第6d、8d均促進了人BMSCs的增殖,其中以10%mPRP濃度組尤為明顯。 5.mPRP對人BMSCs礦化的作用 5%和10%濃度的mPRP均顯著提高了礦化培養(yǎng)7d后人BMSCs的ALP活性；連續(xù)礦化培養(yǎng)21d后,5%mPRP組中茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)面積比顯著大于對照組(10%FBS組)。 6.mPRP對人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA表達的作用 RT-PCR顯示5%濃度mPRP培養(yǎng)的人BMSCs礦化誘導組OCN和RUNX-2mRNA的相對表達量較對照組顯著上調(diào)。 結(jié)論 本實驗成功分離培養(yǎng)的人BMSCs具有干細胞特性,表達干細胞表面標記物,且具有成骨向、成脂向分化能力。與胎牛血清比較,5%-10%的mPRP顯著促進了人BMSCs的增殖,其中以10%濃度組尤為顯著；5%的mPRP具有促進人BMSCs成骨向分化的作用。結(jié)果表明mPRP在體外促進人BMSCs增殖與分化的作用具有濃度特異性,將自體來源mPRP用于以人BMSCs為種子細胞的骨組織工程中具有較高的生物安全性。
【關(guān)鍵詞】：改良富血小板血漿 骨髓間充質(zhì)干細胞 增殖 礦化
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-21
• 第一章 人BMSCs的體外培養(yǎng)和鑒定21-37
• 1 材料21-24
• 2 方法24-28
• 3 結(jié)果28-32
• 4 討論32-37
• 第二章 mPRP對人BMSCs體外增殖和免疫原性的作用37-46
• 1 材料37-38
• 2 方法38-40
• 3 結(jié)果40-43
• 4 討論43-46
• 第三章 mPRP體外培養(yǎng)對人BMSCs成骨向分化的作用46-61
• 1 材料46-48
• 2 方法48-53
• 3 結(jié)果53-58
• 4 討論58-61
• 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻62-66
• 英文縮略詞簡表66-67
• 攻讀碩士學位期間主要成果67-68
• 致謝68-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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7 李洪濤;段建民;張宏斌;片山直;;液氮凍融洗滌血小板對人牙髓細胞增殖的影響[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2010年06期

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本文編號：939913