發(fā)布時間：2017-09-29 02:24

  本文關鍵詞：IKK與Rictor相互作用并調(diào)節(jié)mTORC2

  更多相關文章： 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mTORC2) IKK Rictor

【摘要】：一、研究背景： 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶,大環(huán)內(nèi)酯類藥物雷帕霉素(rapamycin)可特異性抑制mTOR。作為細胞內(nèi)多種生理活動的中心調(diào)控分子,mTOR可接受并整合細胞內(nèi)外的各種刺激如激素、生長因子、營養(yǎng)、能量、缺氧、應激等,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯、細胞生長、增殖、存活、自噬、遷移、血管形成等生理過程。人類一系列重大疾病如癌癥、心血管疾病、移植排斥及自體免疫紊亂、糖尿病、肥胖、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等均涉及mTOR信號的失調(diào),mTOR信號通路成為近年生命科學領域的研究熱點。mTOR在細胞內(nèi)通過與其它分子形成復合物發(fā)揮其生物學活性,目前認為主要有兩種復合mTORC1(mTOR complex1)和mTORC2(mTOR comp-lex2)。 mTORCl由mTOR、Raptor (regulatory-associated protein of mTOR)和LST8/GβL (G protein unit-like protein)組成,能接受激素、生長因子、營養(yǎng)及能量、應激等刺激并對rapamycin敏感。生長因子、胰島素等可通過與受體結(jié)合并活化肌醇三磷酸激酶(PI-3K),后者通過PI-3K依賴的激酶1(PDK1)激活蛋白激酶B(PKB/Akt)。激活的Akt可磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復合物2(tuberous sclerosis complex2,TSC2)并減弱其對小G蛋白Rheb的抑制作用�；罨腞heb則激活mTORC1. mTORC1下游的直接底物為S6K1(p70S6kinase)和4E-BP1(eIF4E binding protein1)。前者被mTOR磷酸化(T389)激活后可通過磷酸化核糖體蛋白S6促進核糖體的發(fā)生,后者磷酸化后活性被抑制,不能再結(jié)合并抑制真核細胞翻譯起始因子eIF4E從而促進cap依賴的翻譯,兩者共同促進蛋白質(zhì)合成。mTORC1還存在負反饋調(diào)控：S6K1的活化可抑制胰島素受體底物1(IRS1)從而負反饋調(diào)控Akt/mTORC1。 mTORC2包括nTOR、mLST8/GβL、Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)和Sinl(SAPK interacting protein1)等。Sinl與Rictor是mTORC2特有的亞單位。mTORC2對Rapamycin不敏感,可被生長因子激活,但機制還不清楚。目前認為其主要功能是作為Akt的激酶磷酸化Akt(S473),在PKB/Akt的激活中起重要作用。此外,mTORC2在細胞生存、代謝、增值和骨架重組中具有重要作用。另外,mTORC2還與蛋白激酶C-a(proein kinase C-a), PKCa(S657)磷酸化及細胞骨架重組的調(diào)節(jié)有關。但相對于mTORC1, mTORC2的調(diào)節(jié)機制目前還很不清楚。 IKK (IkB kinase, IkB激酶)/NFkB是介導炎癥反應的主要信號通路。IKK是由IKKα、IKKβ和IKKγ/NEMO三個亞基組成的蛋白復合物,其中IKKα、IKKβ是催化亞基,IKKy/NEMO是調(diào)節(jié)亞基。IKK可被TNFα、IL1、LPS等刺激活化,介導炎癥反應、免疫應答等過程。IKKβ在乳腺癌、前列腺癌、大腸癌、肝癌等多種腫瘤組織中也被廣泛激活,且激活程度與其惡性程度成正相關,表明IKK對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展主要通過兩種途徑：其一,通過依賴NFkB的途徑。IKK是NFkB信號通路的關鍵分子,它的作用是磷酸化IκB,使其發(fā)生泛素化降解,而促使NFkB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；其二,通過不依賴NFkB的途徑。最近研究發(fā)現(xiàn),IKK可通過磷酸化并抑制TSC1來激活mTORC1,從而促進血管表皮生長因子(VEGF)的合成與腫瘤血管形成。還有報道m(xù)TORC1是IKK的上游,它通過其成員Raptor與IKK相互作用可以調(diào)節(jié)NFkB活性。因此,炎癥反應可通過IKK與mTORC1這兩條關鍵信號通路之間的相互作用調(diào)節(jié)細胞生長與腫瘤發(fā)生。然而IKK是否可以調(diào)節(jié)mTORC2信號,目前沒有報道。 二、目的： 研究IKK對mTORC2的調(diào)節(jié)作用及其分子機制。本實驗通過HEK293、MCF-7和NIH3T3等細胞系研究IKK與mTORC2特有成員Rictor的相互作用及其對mTORC2信號通路影響的研究,以建立新的IKK與mTOR信號之間的聯(lián)系與相互作用(crosstalk),為mTOR信號調(diào)節(jié)機制和IKK、mTORC2相關疾病的發(fā)病機理提供新內(nèi)容和藥物研究提供新的靶點選擇。 三、研究方法： 實驗主要是將不同的細胞系通過各種方法抑制(抑制劑、siRNA及激酶失活型質(zhì)粒)或者激活(野生型及活化型質(zhì)粒)IKK信號,檢測對mTORC2下游Akt (S473)磷酸化和細胞骨架的影響。還通過免疫共沉淀的方法檢測外源性及內(nèi)源性IKK與Rictor之間的相互作用,這種相互作用受IKK活性狀態(tài)(抑制或激活)的影響,IKK與Rictor之間的相互作用影響了mTORC2的組裝(Rictor與mTOR之間的相互作用)及mTORC1的組裝(Raptor與mTOR之間的相互作用),其證實了IKK是通過與Rictor相互作用影響mTORC2的組裝從而調(diào)節(jié)mTORC2。 四、研究結(jié)果 1、IKK對mTORC2信號的調(diào)節(jié) IKK是否能與mTORC2相互作用并調(diào)節(jié)mTORC2信號,目前是沒有報道的。我們通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),在HEK293和MCF-7細胞中,內(nèi)源性與過表達的IKKa和IKKp與內(nèi)源性或過表達的Rictor都具有相互作用。為了更進一步的精確rictor的那一部分結(jié)構(gòu)域與IKKα和IKKβ有相互作用,以及是否為直接作用,我們將Rictor分為五個片段Rictor1-5(氨基酸1-398；氨基酸335-733；氨基酸667-1067；氨基酸999-1397；氨基酸1323-1708),并通過GST-pulldown實驗結(jié)果證明：IKKa和IKKp與GST-Rictor4(999-1397aa)具有直接相互作用。 2、IKK抑制劑可抑制(?)mTORC2的活性 我們進一步探討了IKK是否影響mTORC2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IKK的抑制劑Bayll-7082在一些細胞內(nèi)(NIH3T3、HEK293、HEK293T)可顯著抑制P-Akt(S473)的水平,并且具有一定的時間和劑量依賴性。體外激酶活性檢測實驗也證明Bayll-7082可抑制mTORC2的激酶活性。這一結(jié)果提示IKK可能正調(diào)節(jié)mTORC2磷酸化Akt(S473)的活性。 3、IKK的siRNA能抑制mTORC2的活性 我們繼續(xù)使用IKKα和IKKβ的siRNA干擾敲低IKKa和IKKβ的表達,用以更進一步的驗證IKK對mTORC2活性的調(diào)節(jié)。IKKa和IKKβ的水平下調(diào)后P-Akt(S473)水平具有明顯的下調(diào)。 4、IKK與PKC的磷酸化水平和細胞骨架重組有關 有研究表明mTORC2可通過調(diào)節(jié)PKCa的磷酸化水平控制細胞骨架重組的功能。通過這些研究,我們考慮IKK是否可以影響PKCa(S657)的磷酸化和細胞骨架的形成。因此,我們用IKK的抑制劑Bayl1-7082處理NIH3T3細胞,發(fā)現(xiàn)P-PKCa(S657)的磷酸化被抑制。未經(jīng)處理的細胞內(nèi),微絲呈正常分布,聚集在細胞邊緣,即細胞質(zhì)中。通過用IKK的抑制劑Bay11-7082、IKK的siRNA處理和過表達無激酶活性(dominant negative, DN)的IKK突變體DN-IKK-α、DN-IKK-β,微絲成束狀分布于細胞中央。這些結(jié)果表明,IKK可以調(diào)節(jié)mTORC2細胞骨架重組功能和PKC的磷酸化。 5、IKK作用于胰島素介導的mTORC2的信號 有文獻報道,mTORC2可以被很多生長因子激活,如胰島素。為了判斷IKK是否作用于胰島素介導的mTORC2信號,我們用IKK的特異性抑制劑Bayl1-7082處理血清饑餓24h的NIH3T3和MCF-7細胞發(fā)現(xiàn)P-Akt(S473)水平也可被Bayl1-7082完全抑制。由此可說明IKK也可調(diào)節(jié)胰島素介導的mTORC2通路。 6、IKK可調(diào)節(jié)Rictor與mTOR相互作用 為了更進一步了解IKK怎樣調(diào)節(jié)mTORC2的,我們首先檢測了IKK是否能影響Rictor與mTOR的相互作用。當細胞用IKK抑制劑Bayl1-7082處理或轉(zhuǎn)染DN-IKKβ后,發(fā)現(xiàn)IKK可影響Rictor與mTOR的相互作用。然而,對Raptor與mTOR的相互作用沒有影響,僅對Raptor具有微弱的下調(diào)。 另有以往研究報道,mTORC2的活性可被Rictor(Thr1135)的磷酸化負反饋激活。因此,我們用IKK的抑制劑Bay11-7082作用于HEK293細胞,發(fā)現(xiàn)Rictor(Thr1135)的磷酸化可被IKK的抑制劑Bay11-7082所抑制的,并且呈現(xiàn)一定的時間和劑量的依賴；同時其對P-Akt(S473)的抑制作用也呈現(xiàn)時間和劑量的依賴。因此,IKK的抑制劑對P-Akt(S473)的抑制作用與其抑制P-Rictor(Thr1135)無關。 mTOR的Ser2481位點是一個自身磷酸化位點,mTOR該位點的磷酸化是mTORC2復合物完整性的標志。mTOR的Ser2448磷酸化位點則由S6K(p70)激活,并主要發(fā)生在mTORCl。然而,我們的實驗中發(fā)現(xiàn),P-mTOR(S2481)和P-mTOR(S2448)可被IKK的抑制劑Bay11-7082所抑制。P-mTOR(S2481)被IKK抑制劑所抑制表明IKK活性對nTORC2組裝很關鍵。P-mTOR(S2448)的抑制可能是IKK可抑制mTORC1/P-S6K所引起的。這些證據(jù)提示,IKK可通過調(diào)節(jié)mTORC2組裝調(diào)節(jié)mTORC2活性。 五、結(jié)論： 綜上所訴,IKK可通過與Rictor直接相互作用,調(diào)節(jié)mTORC2的組裝與mTORC2的活性和功能。這一研究結(jié)果建立了一條新的IKK與nTORC2信號之間的相互作用,為mTOR言號通路的調(diào)節(jié)機制提供新內(nèi)容,為IKK、mTORC2信號相關疾病的研究藥物研究提供了新的靶點選擇。
【關鍵詞】：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mTORC2) IKK Rictor
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-28
• 材料28-30
• 1.1 主要儀器設備28
• 1.2 細胞系28-29
• 1.3 質(zhì)粒29
• 1.4 試劑及耗材29-30
• 實驗方法30-39
• 2.1 主要溶液配制30-32
• 2.2 細胞培養(yǎng)32
• 2.3 siRNA轉(zhuǎn)染細胞敲低IKKα/β及mTOR相關蛋白水平32-34
• 2.4 Western blot檢測Bay、siRNA、質(zhì)粒等處理后對mTORC2活性的影響34-36
• 2.5 免疫共沉淀與體外蛋白激酶活性檢測36-37
• 2.6 GST pull down37-38
• 2.7 細胞骨架染色38-39
• 實驗結(jié)果39-53
• 3.1 IKK可與Rictor相互作用,且具有直接相互作用39-41
• 3.2 IKK的抑制劑Bay11-7082可引起Akt(S473)磷酸化下調(diào)——時間與劑量效應41-43
• 3.3 siRNA干擾敲低IKKα和IKKβ可引起Akt(S473)快速去磷酸化43-45
• 3.4 IKK影響mTORC2的細胞骨架重組功能及其可能的機制45-47
• 3.5 胰島素激活mTORC2依賴于IKK47-48
• 3.6 IKK可調(diào)節(jié)Rictor與mTOR的相互作用48-50
• 3.7 抑制IKK也可使IKK與Raptor的相互作用減弱50-51
• 3.8 IKK除了可抑制P-Akt(S473)的磷酸化外,還可以引起Rictor與mTOR的快速去磷酸化——時間與劑量51-53
• 討論53-55
• 全文主要結(jié)論55-56
• 參考文獻56-62
• 中英文縮略詞對照表62-64
• 成果64-65
• 致謝65-66

【共引文獻】

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