本文關(guān)鍵詞：基于NP和M1蛋白的通用型甲型流感疫苗的研究

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【摘要】：研究背景 流感病毒（influenza virus）是一種能夠引起嚴(yán)重呼吸道傳染性疾病的RNA病毒，屬正粘病毒科。根據(jù)其內(nèi)部核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（M）的抗原性不同，流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三種類型，其中，甲型流感病毒又根據(jù)HA分為17種亞型，NA分為9種亞型，能組成153個(gè)血清型甲型流感病毒。甲型流感病毒在上個(gè)世紀(jì)曾引起三次大范圍的流行，2009年新型甲型H1N1流感病毒在214個(gè)國(guó)家爆發(fā)流行，2013年3月底，一場(chǎng)突來(lái)的由H7N9引起的禽傳染人流感讓這個(gè)春天驟然緊張起來(lái)，再次突顯了甲型流感病毒感染的嚴(yán)重性。 接種疫苗是預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最有效的手段，目前批準(zhǔn)上市的甲型流感疫苗主要有四種：全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗。這些疫苗都對(duì)同亞型甲型流感病毒感染預(yù)防有效，但在不同亞型甲型病毒之間的保護(hù)效果較弱甚至沒(méi)有。此外，甲型流感病毒的變異速度非�？�，疫苗每年都需更換，給疫苗的生產(chǎn)制備造成諸多不便。世界衛(wèi)生組織（WHO）依據(jù)當(dāng)年全世界范圍流感病毒變化情況來(lái)預(yù)測(cè)并推薦下一年流感疫苗生產(chǎn)所用組分，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度將會(huì)直接影響疫苗的保護(hù)效率，若預(yù)測(cè)失敗將會(huì)造成流感爆發(fā)流行的潛在威脅。因此，通用型甲型流感疫苗的研究迫在眉睫。 通用型甲型流感疫苗研究的靶點(diǎn)主要集中在HA的保守片段、M2e和內(nèi)部蛋白NP和M1上，最初人們關(guān)于通用型甲型流感疫苗的研究主要基于M2e和HA的保守部位，但是M2e和HA提供的交叉保護(hù)不夠全面，不能滿足人們對(duì)通用型流感疫苗的要求，至今仍無(wú)批準(zhǔn)上市的通用型流感疫苗，越來(lái)越多的研究開(kāi)始瞄準(zhǔn)甲型流感病毒中高度保守的NP和M1蛋白。甲型流感病毒特異的T細(xì)胞反應(yīng)具有廣泛的跨亞型保護(hù)作用，日益引起研究的關(guān)注。而誘發(fā)此類特異T細(xì)胞反應(yīng)的主要是病毒內(nèi)部的NP和M1蛋白。熱休克蛋白HSPs（Heat shock proteins），如HSP60，HSP70和gp96的，可直接作用于抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell,APC），也可作為鏈接先天免疫和獲得性免疫的紐帶。我們首次選擇基于NP和M1蛋白，以熱休克蛋白60（Heat shock protein60，HSP60）為分子內(nèi)佐劑的通用型甲型流感疫苗研究。 目的 本研究的目的是克隆、表達(dá)并純化重組NP-M1-HSP60融合蛋白，免疫BALB/c小鼠，評(píng)價(jià)其免疫原性及免疫保護(hù)性，為候選通用流感疫苗抗原提供新靶標(biāo)，為發(fā)展安全、有效、具有廣泛保護(hù)作用的通用型甲型流感疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法與結(jié)果 第一部分候選通用型甲型流感疫苗免疫生物信息學(xué)分析及分子設(shè)計(jì) 通過(guò)BLAST在線分析，選取了流感病毒A/Panama/2007/1999株的NP和M1序列為模板序列，成功設(shè)計(jì)了以GGGPGGG為linker連接NP、M1、HSP60組成重組基因NP-M1和NP-M1-HSP60的模式。通過(guò)軟件Protean程序及在線蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)ExPASy，對(duì)蛋白NP、M1、HSP60及重組蛋白NP-M1、NP-M1-HSP60進(jìn)行基本理化性質(zhì)、柔性、親水性、表位、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，驗(yàn)證了NP-M1和NP-M1-HSP60重組抗原作為通用型流感疫苗抗原的合理性。 第二部分候選通用型甲型流感疫苗抗原的表達(dá)、純化及鑒定 通過(guò)基因工程方法，構(gòu)建并鑒定獲得pET28a-NP-M1-HSP60、 pET28a-NP-M1及pET28a-HSP60重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在37℃的溫度條件下獲得了以包涵體形式表達(dá)為主的重組蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60。經(jīng)溫度條件優(yōu)化，在26℃的溫度條件下獲得了以可溶性表達(dá)的重組蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60。采用層析方法獲得純化的重組蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60。Western Blot檢測(cè)證明重組蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60具有免疫活性。經(jīng)SDS-PAGE鑒定純化得到了純度＞85%的目的蛋白。 第三部分候選通用型甲型流感疫苗免疫原性和保護(hù)性的初步評(píng)價(jià) 測(cè)定純化后目的蛋白的濃度，與SP01水包油乳劑佐劑等體積混合后，以10μg為免疫劑量，噴鼻途徑免疫小鼠。采用間接ELISA、ELISOPT等方法對(duì)疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)的免疫原性及免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，候選流感通用疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，IgG亞型分析及ELISPOT結(jié)果表明該候選疫苗可誘導(dǎo)相對(duì)均衡的Th1和Th2反應(yīng)，并且能夠產(chǎn)生黏膜局部免疫應(yīng)答。隨后，用甲型流感病毒A/Beijing/501(H1N1)株、A/PR/8/34(H1N1)株和A/Ostrich/Suzhou/097/2003(H5N1)株進(jìn)行致死性攻擊后，疫苗免疫組的保護(hù)率分別為100%、100%和67%，并能降低小鼠肺組織的病理?yè)p傷和小鼠組織病毒滴度。以上結(jié)果表明，基于NP和M1通用型甲型流感疫苗具有良好的免疫原性和交叉保護(hù)作用。 結(jié)論 本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，成功制備了基于流感病毒NP和M1蛋白的候選通用型甲型流感疫苗抗原，并進(jìn)一步進(jìn)行了免疫原性和免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該抗原具有很好的免疫原性，，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和黏膜局部免疫應(yīng)答，并且能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)效果，為通用型甲型流感疫苗的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：流感 流感病毒 NP M1 通用型甲型流感疫苗
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-18
• 第一部分 候選通用型甲型流感疫苗免疫生物信息學(xué)分析及分子設(shè)計(jì)18-26
• 材料19
• 方法19-20
• 結(jié)果20-24
• 討論24-26
• 第二部分 候選通用型甲型流感疫苗抗原的表達(dá)、純化及鑒定26-54
• 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 方法29-39
• 結(jié)果39-53
• 討論53-54
• 第三部分 候選通用型甲型流感疫苗免疫原性和保護(hù)性的初步評(píng)價(jià)54-71
• 材料54-56
• 方法56-62
• 結(jié)果62-68
• 討論68-71
• 小結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 綜述78-91
• 參考文獻(xiàn)87-91
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷91-92
• 致謝92-93
• 附錄93-98

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：934413