本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應(yīng)的影響

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【摘要】：目的：通過建立傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.typhi)感染的細(xì)胞模型,用自噬阻斷劑氯喹(chloroquine, CQ)和Beclin1過表達(dá)技術(shù),研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對(duì)人巨噬細(xì)胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應(yīng)的影響,為進(jìn)一步闡明該質(zhì)粒增強(qiáng)宿主菌毒力的分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1自噬過程的影響 1.CQ對(duì)THP-1細(xì)胞自噬阻斷濃度的確定 CQ是一種治療瘧疾的藥物,近年來被廣泛用作自噬阻斷劑,它通過提高溶酶體的pH值使酸性水解酶失活,導(dǎo)致自噬溶酶體無法分解底物,造成自噬相關(guān)蛋白的累積。本實(shí)驗(yàn)以0、10、20、30、40、50、60、70和80μM CQ的培養(yǎng)液作用THP-1細(xì)胞6h,用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(western blot, WB)檢測自噬底物蛋白p62的累積水平;作用細(xì)胞24h后,用噻唑藍(lán)還原法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測細(xì)胞存活率。 2.CQ對(duì)受試菌的影響 用上述方法測定的CQ適宜濃度作用受試菌24h,OD600測定菌液濃度,檢測該濃度CQ對(duì)細(xì)菌的影響。 3.CQ對(duì)THP-1細(xì)胞感染模型自噬的影響 由于傷寒沙門菌只感染人類的嚴(yán)格宿主特異性,本實(shí)驗(yàn)以攜帶傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98的野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-ΔpRST98和將pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入的回補(bǔ)株ST8-c-pRST98為受試菌,分別與人巨噬細(xì)胞THP-1共培養(yǎng)建立感染模型。用對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)50：1感染細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立自噬阻斷劑CQ干預(yù)組。將細(xì)菌與細(xì)胞共作用1h后吸取上清,加入含100μg/ml的阿米卡星(amikacin, AMK)培養(yǎng)液作用2h以去除胞外菌,將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細(xì)胞中釋放至培養(yǎng)液中的細(xì)菌生長。分別在感染的1h和3h收獲細(xì)胞：①WB檢測細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈-Ⅱ (microtubule-associated protein1light chain3-II,MAP1-LC3-II)及自噬底物蛋白p62表達(dá);②將帶有紅色和綠色熒光的mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后,用共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)觀察細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體的變化。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1凋亡和炎癥反應(yīng)的影響 beclin1基因是第一個(gè)被確認(rèn)的哺乳動(dòng)物自噬調(diào)控基因,其編碼產(chǎn)物Beclin1是自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白。本部分實(shí)驗(yàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將外源性beclin1基因?qū)隩HP-1細(xì)胞,研究Beclin1蛋白過表達(dá)后傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響。感染模型建立同第一部分,分別設(shè)野生株ST8、突變株ST8-ApRST98和回補(bǔ)株ST8-c-pRST98感染的Beclin1過表達(dá)組及對(duì)照組,共6組。在感染后1h、3h、5h、9h和13h收獲細(xì)胞：①WB檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Beclin1表達(dá)效率;②Annexin.V-FITC/Propidium Iodide (Ann.V/PI)雙染流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分析細(xì)胞凋亡率;③酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assayELISA)檢測細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18, IL-18)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)。 結(jié)果： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1自噬過程的影響 1.WB檢測自噬底物蛋白p62結(jié)果顯示,30μMCQ作用THP-1細(xì)胞6h后,p62已出現(xiàn)明顯累積(p0.01),40μMCQ作用細(xì)胞6h后,累積程度達(dá)到飽和。MTT法檢測結(jié)果顯示，30μM和40μMCQ作用細(xì)胞24h后存活率分別為58.58%和46.03%。 2.OD600測定菌液濃度結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,30μMCQ對(duì)3株受試菌菌量未見明顯影響。參照文獻(xiàn),30μMCQ作用THP-1細(xì)胞6h,自噬底物蛋白p62出現(xiàn)明顯累積,作用細(xì)胞24h后,細(xì)胞存活率超過50%,且對(duì)細(xì)菌未見明顯影響,因此將30μM作為CQ的后續(xù)工作濃度。 3.WB檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和底物蛋白p62結(jié)果顯示,細(xì)菌與細(xì)胞共作用1h,CQ干預(yù)組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值明顯高于對(duì)照組(p0.01),其中突變株ST8-ApRST98LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值的增加量均高于野生株ST8及回補(bǔ)株ST8-c-pRST98(p0.05)。細(xì)菌與細(xì)胞共作用3h,CQ干預(yù)組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值較對(duì)照組上升(p0.05),但突變株ST8-ΔpRST98的上升量仍顯著高于野生株ST8及回補(bǔ)株ST8-c-pRST98(P0.01)。 4.用mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后,CLSM檢測結(jié)果顯示,細(xì)菌與細(xì)胞共作用1h,CQ干預(yù)組突變株ST8-ΔpRST98感染細(xì)胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量高于對(duì)照組,而野生株ST8和回補(bǔ)株ST8-c-pRST98感染細(xì)胞中未見顯著差異。細(xì)菌與細(xì)胞共作用3h,CQ干預(yù)組3株菌感染細(xì)胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量均高于對(duì)照組,其中突變株ST8-ΔpRST98的上升量顯著高于野生株ST8及回補(bǔ)株ST8-c-pRST98(P0.01)。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1凋亡和炎癥反應(yīng)的影響 1.FCM檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,Beclin1蛋白過表達(dá)組,在細(xì)菌與細(xì)胞共作用的1h、3h、5h和9h,野生株ST8、回補(bǔ)株ST8-c-pRST98及突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細(xì)胞的凋亡率均上升;細(xì)菌與細(xì)胞共作用13h,野生株、回補(bǔ)株與突變株感染THP-1的凋亡率未見顯著性差異。對(duì)照組在細(xì)菌與細(xì)胞共作用的1h和3h,凋亡率未見顯著差異。細(xì)菌與細(xì)胞共作用5h、9h和13h,突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細(xì)胞凋亡率低于野生株ST8和回補(bǔ)株ST8-c-pRST98感染組(p0.05),且隨時(shí)間延長愈加明顯。 2.ELISA檢測細(xì)胞因子結(jié)果顯示,細(xì)菌和細(xì)胞共作用1h、3h和5h,Beclin1過表達(dá)組及對(duì)照組突變株感染細(xì)胞的IL-1β及IL-18表達(dá)水平高于野生株和回補(bǔ)株(p0.05),而突變株感染細(xì)胞的IL-10表達(dá)水平低于野生株和回補(bǔ)株(p0.05)。但細(xì)菌與細(xì)胞共作用9h后,野生株、回補(bǔ)株與突變株感染細(xì)胞的IL-1β、IL-18和IL-10表達(dá)水平未見顯著差異。細(xì)菌和細(xì)胞共作用1h、3h和5h,Beclin1蛋白過表達(dá)組較對(duì)照組3株受試菌感染THP-1細(xì)胞的IL-1β及IL-18表達(dá)水平上升,而IL-10表達(dá)水平下降。細(xì)菌與細(xì)胞共作用9h,3株受試菌感染THP-1細(xì)胞IL-1β、IL-18和IL-10表達(dá)水平未見顯著差異。 結(jié)論： 1.CQ干預(yù)前后,比較THP-1細(xì)胞自噬過程中自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白p62、自噬體和自噬溶酶體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98作用在THP-1細(xì)胞自噬過程的前期,早于溶酶體降解的過程。 2. Beclin1作為自噬標(biāo)志蛋白,過表達(dá)后可上調(diào)沙門菌感染細(xì)胞的自噬水平及凋亡率,加劇細(xì)胞炎癥反應(yīng)并最終影響感染的結(jié)局。
【關(guān)鍵詞】：傷寒沙門菌 質(zhì)粒 巨噬細(xì)胞 自噬 CQ Beclin1
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 引言13-17
• 主要技術(shù)路線16-17
• 第一部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)人巨噬細(xì)胞THP-1自噬過程的影響17-31
• 1 材料與方法17-22
• 2 結(jié)果22-29
• 3 討論29-31
• 第二部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)THP-1凋亡和炎癥反應(yīng)的影響31-44
• 1 材料與方法31-35
• 2 結(jié)果35-41
• 3 討論41-44
• 小結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 綜述 巨噬細(xì)胞在沙門菌感染中作用的研究新進(jìn)展48-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 英文縮略詞表56-58
• 攻讀學(xué)位期間本人公開發(fā)表的論文58
• 本課題所獲基金資助58-59
• 致謝59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 祁汝峰;顧冠彬;黃瑞;;傷寒沙門菌耐藥質(zhì)粒體內(nèi)接合轉(zhuǎn)移的研究[J];微生物與感染;2007年03期

2 吳淑燕;李瓊;儲(chǔ)元元;李Z腦，

本文編號(hào)：921308