本文關(guān)鍵詞：涎腺分泌蛋白Salp15對(duì)全溝硬蜱傳播萊姆病螺旋體效能的影響

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【摘要】：為了吸取宿主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),蜱吸血過程中會(huì)分泌涎液涎液能夠阻礙宿主凝血,抑制宿主的炎癥反應(yīng)并改變其免疫應(yīng)答,最終也影響著其作為媒介傳播病原的能力涎腺激促的病原體傳播(Salivary active transmission,SAT)是蜱媒病傳播的主要方式,分離及鑒定涎腺中具有生物活性的物質(zhì),將是明確媒介蜱與病原及宿主之間的關(guān)系的必須步驟,對(duì)于揭示蜱類傳播病原體的生理機(jī)制具有十分重要的科學(xué)機(jī)制,也將可從傳播阻斷角度開發(fā)新型疫苗以應(yīng)對(duì)層出不窮的蜱媒疾病本文基于全溝硬蜱對(duì)多種病原體,如細(xì)菌原蟲病毒立克次體等的高效傳播能力,以萊姆病為蜱媒病代表,通過對(duì)全溝硬蜱的涎腺蛋白Salp15編碼序列的克隆原核表達(dá)得到涎腺蛋白Salp15,利用動(dòng)物免疫和實(shí)驗(yàn)傳播來探討全溝硬蜱涎腺在萊姆病螺旋體感染和傳播中的地位和作用,以期揭示蜱類涎腺對(duì)病原體的作用機(jī)制,繼而從傳播阻斷角度探索利用涎腺蛋白阻斷蜱媒病原體傳播的可能性和可行性 1.全溝硬蜱復(fù)合組Salp15蛋白超家族多樣性 本文利用涎腺RNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)研究了Salp15蛋白在全溝硬蜱涎腺的基因編碼轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況,結(jié)果表明,全溝硬蜱的Salp15基因僅在叮咬吸血階段轉(zhuǎn)錄,而在非叮咬的狀態(tài)下未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄;對(duì)吸血期全溝硬蜱的檢測(cè),獲取了全溝硬蜱5條唾液腺蛋白Salp15序列:Ipers-2Ipers-3Ipers-4Ipers-1Ipers-5,其中于幼蜱中擴(kuò)增出Ipers-2Ipers-3Ipers-4,若蜱中擴(kuò)增出Ipers-1,成蜱中擴(kuò)增出Ipers-5;經(jīng)氨基酸序列相似性比較,Ipers-3與篦子硬蜱的iric-3相似性最大,達(dá)94.4%,Ipers-2與Ipers-3相似性其次達(dá)89.1%,Ipers-2與iric-2相似性最小為53.1%;一種蜱中可以同時(shí)表達(dá)多種Salp15蛋白成員,即呈現(xiàn)出多樣性結(jié)合全溝硬蜱復(fù)合組其他成員的Salp15的轉(zhuǎn)錄情況(如本課題組完成的中華硬蜱的轉(zhuǎn)錄情況),綜合分析,Salp15的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)是多樣性的 2.全溝硬蜱涎腺分泌蛋白Salp15的融合表達(dá) 為了應(yīng)對(duì)分泌型蛋白表達(dá)的特殊性,本文在對(duì)Salp15蛋白序列的分析和預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上,通過添加MBP標(biāo)簽序列的的策略,以pMal-c4x載體為基骨構(gòu)建了重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染大腸桿菌Transetta DE3細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)了salp15蛋白的表達(dá),并得到了Western-blotting法特異性檢測(cè)驗(yàn)證,該融合蛋白Ipers-5親和層析純化后,濃度達(dá)到1.2mg/ml,純度達(dá)到93%Factor Xa酶切去除融合蛋白的MBP標(biāo)簽后,得到了與預(yù)期分子量大小一致的蛋白片段15kDa,為之后的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)及傳播阻斷實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ) 3.Salp15蛋白Ipers-5對(duì)螺旋體的傳播阻斷效應(yīng)初步評(píng)價(jià) 以螺旋體敏感系C3H鼠作為免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,兩種螺旋體菌株Borreliaburgdorferi sense lato B31, Borrelia garinii NMJW-1為實(shí)驗(yàn)菌株通過腹腔注射及蜱蟲叮咬傳播的方法傳染螺旋體,非免疫組小鼠皆檢測(cè)到高載量的螺旋體,而免疫組中的螺旋體感染量顯著降低,初步展示了Salp15抗體對(duì)螺旋體感染和傳播的阻斷作用 綜上所述:全溝硬蜱涎腺Salp15基因僅在吸血階段轉(zhuǎn)錄或表達(dá),Salp15基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄有差異性,導(dǎo)致了Salp15蛋白多樣性的產(chǎn)生利用pMal-c4x重組表達(dá)和質(zhì)粒和大腸桿菌Transetta DE3,可成功表達(dá)Salp15蛋白所表達(dá)的Salp15蛋白能夠有效誘導(dǎo)C3H小鼠高滴度的抗體產(chǎn)生;萊姆病螺旋體敏感C3H小鼠,經(jīng)免疫Salp15蛋白后可有效降低螺旋體感染和傳播,展示了良好的傳播阻斷潛能
【關(guān)鍵詞】：全溝硬蜱 Salp15 唾液腺 傳播阻斷性疫苗
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R377
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-16
• 一 全溝硬蜱復(fù)合組Salp15蛋白超家族的多樣性16-30
• 1.1 全溝硬蜱Salp15編碼序列的擴(kuò)增16-20
• 1.2.1 材料16
• 1.2.2 方法16-20
• 1.2.2.1 全溝硬蜱唾液腺蛋白Salp15 CDS序列擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)17
• 1.2.2.2 全溝硬蜱叮咬17-18
• 1.2.2.3 半飽血蜱RNA提取18
• 1.2.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因及克隆18-20
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-24
• 1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)全溝硬蜱RNA20-21
• 1.3.2 Salp15 目的片段的擴(kuò)增和克隆21-24
• 1.4 討論24-30
• 1.4.1 硬蜱屬蜱類Salp15蛋白的多樣性24-29
• 1.4.2 全溝硬蜱Salp15蛋白家族在轉(zhuǎn)錄水平上的多樣性29
• 1.4.3 全溝硬蜱Salp15蛋白Ipers-529-30
• 二 Salp15蛋白Ipers-5融合蛋白表達(dá)體系建立及優(yōu)化30-44
• 1.1 材料30-33
• 1.2 方法33-38
• 1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建33-35
• 1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白35-36
• 1.2.3 融合蛋白的純化36-37
• 1.2.4 酶切重組蛋白,去MBP標(biāo)簽蛋白37
• 1.2.5 純化去標(biāo)簽的融合蛋白37-38
• 1.2.6 Western-blotting38
• 1.3 結(jié)果38-43
• 1.3.1 陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果38-39
• 1.3.2 融合蛋白的表達(dá)39-41
• 1.3.3 融合蛋白純化41-42
• 1.3.4 Western-blotting分析融合蛋白42
• 1.3.5 融合蛋白去標(biāo)簽并純化42-43
• 1.4 討論43-44
• 三 Salp15家族蛋白對(duì)萊姆病螺旋體Borrelia burgdorferi(B31)、Borreliagarnii(VH7)感染的拮抗作用44-58
• 1 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)螺旋體方法的建立44-52
• 1.1 材料44
• 1.2 方法44-47
• 1.2.1 菌種的培養(yǎng)與保存44
• 1.2.2 螺旋體基因組提取44-45
• 1.2.3 小鼠血液基因組提取45
• 1.2.4 萊姆病螺旋體目的基因Flagellin擴(kuò)增45-46
• 1.2.4.1 Borrelia garinii目的基因擴(kuò)增45
• 1.2.4.2 Borrelia burgdorferi目的基因擴(kuò)增45-46
• 1.2.4.3 Taqman法熒光定量PCR繪制Flagellin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線46
• 1.2.5 Taqman法熒光定量PCR繪制小鼠的β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線46-47
• 1.3 結(jié)果47-51
• 1.3.1 螺旋體鞭毛蛋白基因的擴(kuò)增47-48
• 1.3.2 兩株螺旋體鞭毛蛋白目的基因片段標(biāo)準(zhǔn)曲線生成48-50
• 1.3.3 小鼠β-actin基因片段的擴(kuò)增50-51
• 1.4 討論51-52
• 2 全溝硬蜱Salp15蛋白Ipers-5對(duì)萊姆病螺旋體傳播阻斷效應(yīng)52-58
• 2.1 材料52
• 2.2 方法52-54
• 2.2.1 Salp15免疫C3H小鼠的實(shí)驗(yàn)方案52
• 2.2.2 間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)52-53
• 2.2.3 感染螺旋體53-54
• 2.2.3.1 隨機(jī)分組小鼠53
• 2.2.3.2 腹腔注射感染小鼠53
• 2.2.3.3 感染蜱叮咬小鼠53-54
• 2.2.3.4 qPCR定量檢測(cè)螺旋體感染量54
• 2.3 結(jié)果54-57
• 2.3.1 小鼠抗體效價(jià)檢測(cè)54
• 2.3.2 普通PCR檢測(cè)螺旋體結(jié)果54-55
• 2.3.3 相對(duì)熒光定量法檢測(cè)結(jié)果55-57
• 2.4 討論57-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 綜述66-77
• References73-77
• 附錄77-79
• 附錄1 本人簡(jiǎn)歷77-78
• 附錄2 在學(xué)期間研究成果目錄78-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 程遠(yuǎn)國(guó),吳厚永,李德昌;長(zhǎng)角血蜱唾液腺中膠原特異性血小板聚集抑制因子的純化及機(jī)制的研究[J];中國(guó)科學(xué)C輯:生命科學(xué);1999年06期

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本文編號(hào)：903404