本文關(guān)鍵詞：STY及SPA的RT-PCR檢測方法的建立

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【摘要】：【目的】 建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測法，具體包括：（1）傷寒沙門氏菌SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。（2）傷寒及甲型副傷寒沙門菌TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。評(píng)價(jià)以上方法的特異性、敏感性、檢測下限、以了解人群中對(duì)該菌的攜帶情況提高感染人群中傷寒及甲型副沙門氏菌的檢出率。 【方法】 對(duì)建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測法，本研究采取以下實(shí)驗(yàn)方案： （1）經(jīng)查閱資料后確定待測目的基因，并通過序列比對(duì)確定待檢測基因的保守序列STY1633（Salmonella Typhi）及SPA4289（Salmonella enterica serovars paratyphiA），然后借助探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer7.7設(shè)計(jì)單重及雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針。 （2）分別在1-10nmol/L10個(gè)濃度梯度和2-10nmol/L5個(gè)濃度梯度內(nèi)，在美國Bio-Rad公司的CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增比較，優(yōu)化引物和探針濃度。 （3）SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度、特異度的評(píng)價(jià)。 （4）SYBR Green法檢測糞便模擬標(biāo)本中的傷寒沙門菌，，評(píng)價(jià)其敏感性、特異度、檢測下限、菌液增菌前后的檢測下限。 （5）單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法靈敏度、特異度的評(píng)價(jià)。 （6）將優(yōu)化了的單重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系組合成雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系，并評(píng)價(jià)其檢測下限。 【結(jié)果】 （1）利用SYBR Green法檢測糞便模擬標(biāo)本中的傷寒沙門菌純菌及10份傷寒患者標(biāo)本均擴(kuò)增陽性，其余的非傷寒沙門菌、致腹瀉的其他5種腸道致病菌及引起發(fā)熱癥狀的8種常見非腸道病原菌純菌及相應(yīng)患者標(biāo)本均擴(kuò)增陰性。在對(duì)純傷寒沙門菌DNA檢測中，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法的檢測下限為500fg/反應(yīng)，即97個(gè)拷貝/反應(yīng)。以糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前檢測下限達(dá)104cfu/g，增菌后可達(dá)50cfu/g。 （2）在單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測傷寒沙門菌的反應(yīng)體系中，優(yōu)化后的反應(yīng)體系靈敏度和特異度均為100％。檢測傷寒沙門菌純菌DNA的檢測下限為100fg/反應(yīng)，即19.4個(gè)拷貝/反應(yīng),擴(kuò)增效率為90%。以傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前檢測下限即可達(dá)1cfu/g。 單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測甲型副傷寒沙門菌純菌DNA的檢測下限2.5pg/反應(yīng)，即485個(gè)拷貝/反應(yīng)，擴(kuò)增效率為90%。以甲型副傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前達(dá)未檢出，但增菌后檢測下限可達(dá)10cfu/g。 （3）經(jīng)優(yōu)化的傷寒和甲型副傷寒雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，對(duì)兩種純菌DNA的檢測下限為分別為1pg/反應(yīng)和2.5pg/反應(yīng)，即194個(gè)拷貝/反應(yīng)和485個(gè)拷貝/反應(yīng)。對(duì)各自的糞便模擬樣品的檢測下限分別為：傷寒糞便模擬樣品增菌前為102cfu/g，增菌后的檢測下限是1cfu/g；甲型副傷寒糞便模擬樣品增菌前為104cfu/g，增菌后的檢測下限是10cfu/g。 【結(jié)論】 本研究建立了基于STY1633基因及SPA4289的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該檢測法的特異度、靈敏度及檢測下限均較理想。尤其在單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測傷寒沙門菌其檢測下限能達(dá)到19.4個(gè)拷貝/反應(yīng)，高于普通PCR檢測法的100-500倍。并且在雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR法能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測傷寒和甲型副傷寒兩種菌。在檢測糞便中的傷寒沙門菌中具有很好的特異性、靈敏度，為傷寒及甲型副傷寒沙門氏菌的診斷及其他原因不明發(fā)熱或腹瀉癥狀的病原初步鑒定提供了新的簡便型手段，對(duì)于傷寒的早期診斷及預(yù)防控制提供了技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：傷寒沙門菌 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 甲型副傷寒沙門菌 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法
【學(xué)位授予單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.22
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 文獻(xiàn)綜述13-23
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第一部分：STY SYBR Green RT-qPCR 體系的建立23-32
• 前言23
• 一、STY SYBR Green RT－qPCR 體系的建立23-31
• 參考文獻(xiàn)31-32
• 第二部分：STY 及 SPA 雙重 TaqMan RT-PCR 體系的建立32-50
• 前言32-33
• 一、SPA TaqMan RT-PCR 體系的建立33-38
• 二、STY TaqMan RT-PCR 體系的建立38-43
• 三、STY 及 SPA 雙重 TaqMan RT-PCR 體系的建立43-46
• 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 致謝50-51
• 英文縮寫51
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文51-52
• 附錄52-53

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