本文關鍵詞：STY及SPA的RT-PCR檢測方法的建立

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【摘要】：【目的】 建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實時熒光定量PCR檢測法，具體包括：（1）傷寒沙門氏菌SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法。（2）傷寒及甲型副傷寒沙門菌TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。評價以上方法的特異性、敏感性、檢測下限、以了解人群中對該菌的攜帶情況提高感染人群中傷寒及甲型副沙門氏菌的檢出率。 【方法】 對建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實時熒光定量PCR檢測法，本研究采取以下實驗方案： （1）經查閱資料后確定待測目的基因，并通過序列比對確定待檢測基因的保守序列STY1633（Salmonella Typhi）及SPA4289（Salmonella enterica serovars paratyphiA），然后借助探針設計軟件Beacon Designer7.7設計單重及雙重實時熒光定量PCR引物和探針。 （2）分別在1-10nmol/L10個濃度梯度和2-10nmol/L5個濃度梯度內，在美國Bio-Rad公司的CFX96熒光定量PCR儀上進行擴增比較，優(yōu)化引物和探針濃度。 （3）SYBR Green實時熒光定量PCR靈敏度、特異度的評價。 （4）SYBR Green法檢測糞便模擬標本中的傷寒沙門菌，，評價其敏感性、特異度、檢測下限、菌液增菌前后的檢測下限。 （5）單重TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度、特異度的評價。 （6）將優(yōu)化了的單重實時PCR反應體系組合成雙重TaqMan實時PCR反應體系，并評價其檢測下限。 【結果】 （1）利用SYBR Green法檢測糞便模擬標本中的傷寒沙門菌純菌及10份傷寒患者標本均擴增陽性，其余的非傷寒沙門菌、致腹瀉的其他5種腸道致病菌及引起發(fā)熱癥狀的8種常見非腸道病原菌純菌及相應患者標本均擴增陰性。在對純傷寒沙門菌DNA檢測中，實時熒光定量聚合酶鏈反應法的檢測下限為500fg/反應，即97個拷貝/反應。以糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前檢測下限達104cfu/g，增菌后可達50cfu/g。 （2）在單重TaqMan實時熒光定量PCR法檢測傷寒沙門菌的反應體系中，優(yōu)化后的反應體系靈敏度和特異度均為100％。檢測傷寒沙門菌純菌DNA的檢測下限為100fg/反應，即19.4個拷貝/反應,擴增效率為90%。以傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前檢測下限即可達1cfu/g。 單重TaqMan實時熒光定量PCR法檢測甲型副傷寒沙門菌純菌DNA的檢測下限2.5pg/反應，即485個拷貝/反應，擴增效率為90%。以甲型副傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前達未檢出，但增菌后檢測下限可達10cfu/g。 （3）經優(yōu)化的傷寒和甲型副傷寒雙重TaqMan實時熒光定量PCR反應體系中，對兩種純菌DNA的檢測下限為分別為1pg/反應和2.5pg/反應，即194個拷貝/反應和485個拷貝/反應。對各自的糞便模擬樣品的檢測下限分別為：傷寒糞便模擬樣品增菌前為102cfu/g，增菌后的檢測下限是1cfu/g；甲型副傷寒糞便模擬樣品增菌前為104cfu/g，增菌后的檢測下限是10cfu/g。 【結論】 本研究建立了基于STY1633基因及SPA4289的實時熒光定量PCR方法。實驗結果證明該檢測法的特異度、靈敏度及檢測下限均較理想。尤其在單重TaqMan實時熒光定量PCR法檢測傷寒沙門菌其檢測下限能達到19.4個拷貝/反應，高于普通PCR檢測法的100-500倍。并且在雙重TaqMan實時PCR法能夠在一個反應體系中同時檢測傷寒和甲型副傷寒兩種菌。在檢測糞便中的傷寒沙門菌中具有很好的特異性、靈敏度，為傷寒及甲型副傷寒沙門氏菌的診斷及其他原因不明發(fā)熱或腹瀉癥狀的病原初步鑒定提供了新的簡便型手段，對于傷寒的早期診斷及預防控制提供了技術支持。
【關鍵詞】：傷寒沙門菌 實時熒光定量聚合酶鏈反應 甲型副傷寒沙門菌 TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法
【學位授予單位】：佳木斯大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 文獻綜述13-23
• 參考文獻19-23
• 第一部分：STY SYBR Green RT-qPCR 體系的建立23-32
• 前言23
• 一、STY SYBR Green RT－qPCR 體系的建立23-31
• 參考文獻31-32
• 第二部分：STY 及 SPA 雙重 TaqMan RT-PCR 體系的建立32-50
• 前言32-33
• 一、SPA TaqMan RT-PCR 體系的建立33-38
• 二、STY TaqMan RT-PCR 體系的建立38-43
• 三、STY 及 SPA 雙重 TaqMan RT-PCR 體系的建立43-46
• 討論46-48
• 結論48-49
• 參考文獻49-50
• 致謝50-51
• 英文縮寫51
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文51-52
• 附錄52-53

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