本文關(guān)鍵詞：人博卡病毒1-4型重組分析及人博卡病毒1型相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建

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【摘要】：目的1.人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)1-4型中僅HBoV1具有完整的基因組序列；且研究發(fā)現(xiàn)HBoV1-4之間可能存在基因重組。因此,獲得HBoV1-4的全基因組或近似全基因組序列,對全面深入分析和研究HBoVs的基因特征及重組具有重要的科學(xué)意義。2.反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat,ITR)對腺相關(guān)病毒的包裝和感染力具有顯著的影響,利用外源質(zhì)粒提供Rep蛋白和Cap蛋白可以體外完成腺相關(guān)病毒或重組病毒的病毒包裝和釋放。因此,構(gòu)建具有HBoV1 ITR的重組質(zhì)粒和NS1、NP1、VP1/2的真核表達(dá)質(zhì)粒對于HBoV1重組病毒相關(guān)研究具有重要的科學(xué)價值。對象和方法1.我國HBoV 1-4型的全基因組擴增及重組分析從南京和蘭州地區(qū)腹瀉患兒糞便標(biāo)本中選擇HBoV單陽性的標(biāo)本,以GenBank來源的近似全基因組為參考株,用primer premier 5.0軟件設(shè)計引物,采用普通PCR及接頭法PCR擴增各基因片段,拼接后獲得HBoV 1-4全基因組。對所獲得的近似全基因組進行同源性比對及進化分析,利用RDP4軟件分析HBoV 1-4間的基因重組關(guān)系。2.HBoV1型相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建將從pEGFP-N1質(zhì)粒上酶切下的EGFP熒光蛋白基因連接于酶切去除NS1、NP1和VP1/2的pIHBoV1質(zhì)粒上,構(gòu)建pITRGFP質(zhì)粒；將HBoV1的編碼區(qū)基因用PCR及酶切的方法最后連接在pcDNA3.1(+)上,構(gòu)建pcRC質(zhì)粒,將pITRGFP及pcRC共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,SDS-PAGE鑒定上述載體構(gòu)建成功與否。結(jié)果1.分別從南京和蘭州地區(qū)的標(biāo)本中擴增得到2條HBoV1、2條HBoV2、2條HBoV3、1條HBoV4近似全基因組序列,其中HBoV4為國內(nèi)首次獲得,HBoV2-NC為目前國內(nèi)外最長全基因組序列；2.HBoV1和HBoV3在各編碼區(qū)變異率較小,而HBoV2和HBoV4變異率較大,可能是潛在HBoV重組病毒株的來源；HBoV3可能由HBoV1和HBoV4重組進化而來,HBoV4可能由HBoV2與HBoV3重組進化而來。3.成功構(gòu)建了HBoV1的相關(guān)載體pITRGFP和pcRC,上述載體在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)了GFP標(biāo)簽蛋白和HBoV1 VP2蛋白。結(jié)論1.擴增得到HBoV1-4的近似全基因組序列；2.HBoV1-4間存在著基因重組；3.成功構(gòu)建了pITRGFP和pcRC質(zhì)粒,對HBoV1的相關(guān)研究有著重要意義。
【關(guān)鍵詞】：人博卡病毒1-4 基因重組 質(zhì)粒構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 第一章 引言8-17
• 1.1 HBoV的分子生物學(xué)特征9-12
• 1.2 HBoV的致病機制12
• 1.3 HBoV與疾病相關(guān)性12-14
• 1.4 HBoV的診斷與治療14
• 1.5 HBoV在基因治療載體領(lǐng)域中的初步研究14-15
• 1.6 研究的目的和意義15-17
• 第二章 人博卡病毒1-4型重組分析17-54
• 2.1 實驗材料17-18
• 2.2 實驗方法18-27
• 2.3 結(jié)果27-51
• 2.4 討論51-54
• 第三章 人博卡病毒1型相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建54-70
• 3.1 實驗材料54-55
• 3.2 實驗方法55-63
• 3.3 實驗結(jié)果63-68
• 3.4 討論68-70
• 結(jié)論70-71
• 全文創(chuàng)新點71-72
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 在學(xué)期間的研究成果77-78
• 致謝78-79
• 中英文對照表79

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