本文關(guān)鍵詞：白紋伊蚊嗅覺受體OR7的基因克隆、鑒定和初步功能分析

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【摘要】：研究背景：蚊是一類重要的媒介昆蟲,它不僅叮咬人類,而且能夠傳染多種疾病,如登革熱、瘧疾、絲蟲病、黃熱病,流行性乙型腦炎等,對人類的健康產(chǎn)生很大危害。蚊子的吸血,交配,產(chǎn)卵等主要依賴于其嗅覺系統(tǒng)。蚊的嗅覺系統(tǒng)主要包括嗅覺結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、嗅覺受體(odorant receptors, ORs)以及嗅覺受體神經(jīng)元(olfactory receptor neurons,ORNs),其主要分布在觸角、上頜須以及喙,其內(nèi)部含有多種形態(tài)各異的嗅覺感應(yīng)器(簡稱嗅器)。在整個嗅覺發(fā)生過程中,嗅覺結(jié)合蛋白和嗅覺受體起著關(guān)鍵作用。因此,蚊嗅覺受體功能的研究,對蚊媒傳染病的防控具有重要意義。 目前研究表明岡比亞按蚊含有79個嗅覺受體基因,埃及伊蚊含有131個嗅覺受體基因,淡色庫蚊含有180個嗅覺受體基因。對白紋伊蚊嗅覺受體基因(Ae. Albopictus olfactory receptor)的研究較晚,國內(nèi)對于白紋伊蚊嗅覺受體基因的研究至今仍是一片空白。直到2012年5月,世界上才有第一個白紋伊蚊嗅覺受體基因的研究報道,即白紋伊蚊嗅覺受體基因2(AalOr2),其編碼區(qū)有6個外顯子被5個內(nèi)含子分離,cDNA全長1556bp,最終的蛋白產(chǎn)物含376個氨基酸,且有7個跨膜區(qū)。 蚊Orco基因是蚊嗅覺受體基因家族的一部分,它能夠和嗅覺受體基因共同作用,識別氣味分子。果蠅,岡比亞按蚊,淡色庫蚊,埃及伊蚊的Orco基因分別是其嗅覺受體基因Or83b,AgOr7,CqOr7,AaeOr7當(dāng)外界氣味分子進入蚊嗅覺系統(tǒng)時,氣味分子首先和嗅覺結(jié)合蛋白(OBP)結(jié)合,OBP將氣味分子運送至嗅覺受體(OR),由于嗅覺受體基因表達在嗅覺受體神經(jīng)元(ORN)細(xì)胞膜上,所以氣味分子的刺激可以改變ORN細(xì)胞膜離子通道的開放或者關(guān)閉,進而影響細(xì)胞膜內(nèi)外電壓的變化。嗅覺受體神經(jīng)元細(xì)胞膜電位的改變信號傳送到蚊中樞神經(jīng)系統(tǒng),進而引起蚊行為的變化,對氣味分子是趨避或者被引誘。至于Orco基因是否可以增強嗅覺受體基因?qū)馕兜淖R別能力,有待于進一步研究證明,現(xiàn)有研究表明Orco基因和Or基因共同作用對于氣味的識別能力具有選擇性。在對部分氣味分子的識別過程中,Orco基因確實可以增強Or基因?qū)τ跉馕兜淖R別能力,但是對于另一部分氣味的識別能力,Orco基因?qū)r的增強作用不是很理想。 避蚊胺(DEET)是常用的蚊媒趨避劑,已廣泛使用近六十年,它可以擾亂蚊子對于人汗液氣味分子的識別功能,起到趨避的效果。吲哚類氣味分子是一種重要的蚊媒引誘劑,吲哚在人體汗液氣味分子占近30%。在用近30種氣味分子刺激白紋伊蚊嗅覺受體基因Or2和黑腹果蠅Orco基因共表達的人類胚胎腎細(xì)胞(HEK293)時,其胞內(nèi)鈣離子的濃度在吲哚刺激下達到最高,這證實了白紋伊蚊嗅覺系統(tǒng)對吲哚的反應(yīng)很強烈,當(dāng)然,在幼蟲行為實驗中,也證實了吲哚對于白紋伊蚊幼蟲的吸引作用�；诖�,本研究用避蚊胺(DEET)和1-甲基3-吲哚兩種氣味分子刺激白紋伊蚊嗅覺受體基因Or7單獨表達和其與岡比亞按蚊Orco基因共表達的HEK293細(xì)胞,研究表明：在氣味分子1-甲基-3-吲哚刺激下,胞內(nèi)鈣離子的濃度逐步上升至峰值；相反,在避蚊胺(DEET)刺激下,其胞內(nèi)鈣離子濃度不斷下降至基線值以下。 蚊嗅覺基因?qū)τ跉馕斗肿訚舛茸兓淖R別是蚊媒嗅覺系統(tǒng)研究的一個熱點。在用五種相同濃度10-3氣味分子刺激埃及伊蚊嗅覺受體基因AaeOr2和AaeOr7共表達的爪蟾卵母細(xì)胞時,發(fā)現(xiàn),細(xì)胞對于避蚊胺(DEET)的反應(yīng)最為強烈。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在埃及伊蚊嗅覺受體基因AaeOr8和AaeOr7共表達的爪蟾卵母細(xì)胞中。有趣的是,當(dāng)用氣味分子吲哚濃度為10-7M刺激兩組共表達的爪蟾卵母細(xì)胞時,細(xì)胞對該濃度下吲哚的反應(yīng)極其強烈,遠高于細(xì)胞在避蚊胺(DEET)為10-3M濃度刺激下的反應(yīng)強度。盡管如此,當(dāng)DEET濃度在10-10M增加到10-5M的過程中,細(xì)胞對DEET的反應(yīng)也逐步增強,并在10-SM濃度時候達到峰值,同樣的變化趨勢也發(fā)生在吲哚的刺激下。更加有趣的是,AaeOr10和AaeOr7共表達的爪蟾卵母細(xì)胞中也出現(xiàn)相同的變化趨勢。這進一步證實了和埃及伊蚊嗅覺受體基因AaeOr7共表達的AaeOr2,AaeOr8,AaeOr10,具有相同的DEET氣味應(yīng)答譜。 研究目的：本研究選擇了一個白紋伊蚊嗅覺受體基因Or7為研究對象,通過實驗技術(shù)等方法分析其可能含有的氣味識別功能及分子機制,為蚊媒傳染病的預(yù)防和控制提供理論基礎(chǔ)。 研究方法： 1.白紋伊蚊嗅覺受體基因Or7的識別及編碼區(qū)全長序列的獲得。以本實驗室白紋伊蚊基因組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),通過tBLASTn的方法,以埃及伊蚊Ors的氨基酸序列作為索引,對白紋伊蚊基因組DNA序列進行同源比對分析,找出白紋伊蚊嗅覺受體基因Or7的部分序列。通過RT-PCR擴增獲得AalOr7編碼區(qū)序列全長,導(dǎo)入p-EASY質(zhì)粒后測序鑒定,從而獲得AalOr7的編碼區(qū)cDNA序列全長。利用生物信息學(xué)技術(shù)對經(jīng)測序鑒定的AalOr7的ORF序列所推導(dǎo)編碼的氨基酸序列進行分析。 2.利用RT-PCR技術(shù),分析AalOr7在白紋伊蚊不同發(fā)育時期及不同組織中的表達情況。 3.以AalOr7的ORF序列和pME18S真核表達載體的多克隆位點設(shè)計引物,以經(jīng)過測序鑒定的p-EASY-AalOr7質(zhì)粒為模板,PCR擴增AalOr7的編碼區(qū)全長序列,將其連接到pME18S載體上,獲得重組質(zhì)粒pME18S-AalOr7。 4.將真核表達載體pME18S-AalOr7轉(zhuǎn)染人類胚胎腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞,通過RT-PCR鑒定其表達情況。 5.選擇1-甲基-3-吲哚,DEET等常用引誘趨避劑,刺激已表達真核表達載體pME18S-AalOr7的HEK293細(xì)胞,進而初步研究AalOr7對于氣味的識別功能。 研究結(jié)果： 1.測序獲得AalOr7基因的編碼區(qū)全長序列是1395bp,其推導(dǎo)的氨基酸序列長度為464aa.通過生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)其推導(dǎo)的氨基酸序列含有跨膜區(qū),可能屬于跨膜蛋白。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),白紋伊蚊Or7與埃及伊蚊Or7之間的同源性為98%。 2.RT-PCR檢測白蚊伊蚊嗅覺受體基因Or7在幼蟲,蛹,成蚊等不同發(fā)育時期都有表達,且在雌蚊的嗅器(喙,觸角,上頜須)中表達明顯,但在雄蚊中的表達量偏低。 3.連接得到真核表達載體pME18S-AalOr7。 4.通過RT-PCR鑒定白紋伊蚊Or7在HEK293細(xì)胞中表達明顯。 5.在1-甲基-3-吲哚、DEET刺激下,利用鈣成像技術(shù),初步檢測HEK293細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,發(fā)現(xiàn),AalOr7對鈣離子具有一定的調(diào)控功能,進而影響細(xì)胞對于氣味的識別能力。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建白紋伊蚊嗅覺受體基因AalOr7的真核表達載體pME18S-AalOr7。 2.AalOr7在白紋伊蚊不同發(fā)育階段都有表達,且在雌蚊嗅器中表達明顯。 3.利用鈣成像技術(shù)初步分析白紋伊蚊嗅覺受體基因AalOr7具有對氣味的識別功能。
【關(guān)鍵詞】：白紋伊蚊 嗅覺受體 克隆表達 表達差異 氣味識別
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R384.1
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-23
• 第一章 白紋伊蚊嗅覺受體Or7(AalOr7)的基因克隆、鑒定23-33
• 1 材料23-25
• 2 方法25-28
• 3 結(jié)果28-31
• 4 討論31-32
• 5 小結(jié)32-33
• 第二章 白紋伊蚊嗅覺受體Or7(AalOr7)的表達譜及生物信息學(xué)分析33-44
• 1 材料33-34
• 2 方法34-37
• 3 結(jié)果37-43
• 4 小結(jié)43-44
• 第三章 白紋伊蚊嗅覺受體基因Or7真核表達載體構(gòu)建44-52
• 1 材料44-46
• 2 方法46-49
• 3 結(jié)果49-51
• 4 小結(jié)51-52
• 第四章 AalOr7對氣味識別初步功能分析52-76
• 1 材料52-55
• 2 方法55-59
• 3 結(jié)果59-71
• 4 討論71-74
• 5 小結(jié)74-76
• 參考文獻76-83
• 碩士期間發(fā)表的論文83-84
• 致謝84-85

【共引文獻】

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本文編號：870257