本文關鍵詞：新型人源性穿膜肽機理研究及性質比較

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【摘要】：細胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs),通常由多個堿性氨基酸構成的帶正電荷的短肽,能夠作為運輸載體,攜帶物質進入到細胞,但其穿膜機制依然存在很大爭議。利用熒光蛋白作為報告蛋白,經過構建、表達純化而得到不同的穿膜肽融合蛋白,利用熒光顯微鏡、激光共聚焦和流式細胞術對其穿膜機制和穿膜效率進行檢測。本實驗通過分子生物學技術,構建得到EGFP-CS、EGFP-CS4、EGFP-TAT、 TAT-mCherry、Nus-S Tag-EGFP-CS、EGFP-CPPs等在內的多種重組蛋白,經表達優(yōu)化,利用Ni-NTA層析柱純化得到的目的蛋白,其純度均可達到95%以上。研究融合蛋白EGFP-TAT、EGFP-CS和EGFP-CS4在不同濃度及不同時間下,對細胞的穿膜效率變化,三者的穿膜作用均具有濃度時間依賴性。通過研究各內吞途徑抑制劑對上述三種融合蛋白對細胞穿膜活性的變化,初步鑒定穿膜肽CS和CS4主要依賴于和細胞膜上的硫酸蛋白聚糖的吸附,另外少量也可以通過其他途徑進入細胞,即可能為混合途徑。穿膜肽CS攜帶大分子量蛋白Nus-S Tag-EGFP,雖然在同濃度下,其熒光活性相對EGFP-CS較弱,但隨濃度增加,可以在細胞內檢測到其熒光活性逐漸增強,這表明大分子物質對穿膜肽的穿膜作用具有一定的影響,但依然可有效對其進行跨膜運輸。將不同穿膜肽作用于多種細胞的研究發(fā)現,穿膜肽CS和CS4具有相對的廣譜性,但對于所選用的MKN和A549兩種細胞,其穿膜效率較差,因此穿膜作用可能具有組織特異性。比較多種人源性穿膜肽的穿膜效率,以篩選出高效、低毒的人源性穿膜肽作為藥物蛋白的穿膜載體,實現其藥理效果,研究表明,多種人源性的穿膜效肽具有較高的穿膜效率,可應用于臨床醫(yī)藥。
【關鍵詞】：穿膜肽 TAT 人源性 EGFP
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：Q51;R329.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 引言9-20
• 1.1 細胞穿膜肽的發(fā)展9-10
• 1.2 細胞穿透肽：多功能的生物分子運輸載體10-11
• 1.3 細胞穿膜肽的分類11-12
• 1.4 細胞穿膜肽的攝入方式及機制研究12-14
• 1.5 影響細胞攝入機制的因素14
• 1.6 細胞穿透肽運輸寡核苷酸14-16
• 1.7 細胞穿透肽的細胞內化機制16-20
• 第二章 材料和方法20-23
• 2.1 材料與儀器20-21
• 2.1.1 酶與生物試劑20
• 2.1.2 培養(yǎng)基配方20
• 2.1.3 大腸桿菌菌株及質粒20
• 2.1.4 動物細胞20
• 2.1.5 細胞培養(yǎng)基20
• 2.1.6 儀器與設備20-21
• 2.2 實驗方法21-23
• 2.2.1 寡核苷酸鏈與表達載體的重組構建21
• 2.2.2 融合蛋白的表達純化21
• 2.2.3 Ni-NTA Agarose柱層析純化21
• 2.2.4 爬片制備21-22
• 2.2.5 流式細胞術22
• 2.2.6 其他22-23
• 第三章 穿膜肽CS和CS4的穿膜機理研究23-47
• 3.1 穿膜肽CS、CS4和TAT相關融合蛋白的構建及表達純化23-29
• 3.1.1 融合蛋白EGFP-CS、EGFP-CS4和EGFP-TAT的純化23-25
• 3.1.2 融合蛋白TAT-mCherry的構建及表達純化25-29
• 3.2 穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用時間依賴性29-30
• 3.3 穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用濃度依賴性30-33
• 3.3.1 激光共聚焦觀察穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用濃度依賴性30-32
• 3.3.2 流式細胞術檢測穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用的濃度依賴性32-33
• 3.4 不同抑制劑對穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用的影響33-36
• 3.5 穿膜肽CS攜帶大分子量貨物蛋白的穿膜作用36-41
• 3.5.1 重組質粒pET43.1-egfp-cs的構建36-39
• 3.5.2 融合蛋白Nus-S Tag-EGFP-CS的表達及純化39-40
• 3.5.3 融合蛋白Nus-S Tag-EGFP-CS對細胞穿膜作用實驗40-41
• 3.5.4 結論41
• 3.6 穿膜肽CS內吞途徑研究41-42
• 3.7 穿膜肽CS、CS4和TAT穿膜作用的細胞特異性42-47
• 3.7.1 穿膜肽CS、CS4和TAT對HeLa細胞穿膜活性比較42-43
• 3.7.2 穿膜肽CS、CS4和TAT對Bcap細胞穿膜活性比較43-44
• 3.7.3 穿膜肽CS、CS4和TAT對A549細胞穿膜活性比較44
• 3.7.4 穿膜肽CS、CS4和TAT對MKN細胞穿膜活性比較44
• 3.7.5 穿膜肽CS、CS4和TAT對OK細胞穿膜活性比較44-45
• 3.7.6 穿膜肽CS、CS4和TAT對CHO細胞穿膜活性比較45-46
• 3.7.7 結論46-47
• 第四章 不同人源性穿膜肽穿膜作用比較47-59
• 4.1 不同人源性穿膜肽重組質粒的構建47-50
• 4.1.1 重組質粒pET28a-egfp-tctp的構建47-48
• 4.1.2 重組質粒pET28a-egfp-arf的構建48
• 4.1.3 重組質粒pET28a-egfp-bagp的構建48
• 4.1.4 重組質粒pET28a-egfp-cyt c的構建48
• 4.1.5 重組質粒pET28a-egfp-hclock的構建48
• 4.1.6 重組質粒pET28a-egfp-hct的構建48-49
• 4.1.7 重組質粒pET28a-egfp-hlf的構建49
• 4.1.8 重組質粒pET28a-egfp-hph的構建49
• 4.1.9 重組質粒pET28a-egfp-nrtn的構建49-50
• 4.2 不同人源性穿膜肽融合EGFP蛋白的表達50-55
• 4.2.1 融合蛋白EGFP-TCTP的表達50
• 4.2.2 融合蛋白EGFP-ARF的表達50-51
• 4.2.3 融合蛋白EGFP-BagP的表達51-52
• 4.2.4 融合蛋白EGFP-Cyt c的表達52
• 4.2.5 融合蛋白EGFP-hClock的表達52-53
• 4.2.6 融合蛋白EGFP-hCT的表達53-54
• 4.2.7 融合蛋白EGFP-hLF的表達54
• 4.2.8 融合蛋白EGFP-Hph的表達54-55
• 4.2.9 融合蛋白EGFP-NRTN的表達55
• 4.3 各人源性穿膜肽融合蛋白EGFP的純化55-56
• 4.4 各人源性穿膜肽對cos-7細胞穿膜作用比較56-58
• 4.5 結論58-59
• 第五章 總結59-60
• 5.1 穿膜肽CS和CS4的穿膜機制研究59
• 5.2 穿膜肽CS和CS4對細胞特異性的研究59
• 5.3 穿膜肽攜帶大分子量物質的穿膜效率研究59
• 5.4 不同人源性穿膜肽的穿膜作用比較59-60
• 參考文獻60-63
• 致謝63

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本文編號：868686