本文關(guān)鍵詞：新型人源性穿膜肽機(jī)理研究及性質(zhì)比較

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【摘要】：細(xì)胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs),通常由多個(gè)堿性氨基酸構(gòu)成的帶正電荷的短肽,能夠作為運(yùn)輸載體,攜帶物質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞,但其穿膜機(jī)制依然存在很大爭(zhēng)議。利用熒光蛋白作為報(bào)告蛋白,經(jīng)過(guò)構(gòu)建、表達(dá)純化而得到不同的穿膜肽融合蛋白,利用熒光顯微鏡、激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其穿膜機(jī)制和穿膜效率進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建得到EGFP-CS、EGFP-CS4、EGFP-TAT、 TAT-mCherry、Nus-S Tag-EGFP-CS、EGFP-CPPs等在內(nèi)的多種重組蛋白,經(jīng)表達(dá)優(yōu)化,利用Ni-NTA層析柱純化得到的目的蛋白,其純度均可達(dá)到95%以上。研究融合蛋白EGFP-TAT、EGFP-CS和EGFP-CS4在不同濃度及不同時(shí)間下,對(duì)細(xì)胞的穿膜效率變化,三者的穿膜作用均具有濃度時(shí)間依賴(lài)性。通過(guò)研究各內(nèi)吞途徑抑制劑對(duì)上述三種融合蛋白對(duì)細(xì)胞穿膜活性的變化,初步鑒定穿膜肽CS和CS4主要依賴(lài)于和細(xì)胞膜上的硫酸蛋白聚糖的吸附,另外少量也可以通過(guò)其他途徑進(jìn)入細(xì)胞,即可能為混合途徑。穿膜肽CS攜帶大分子量蛋白Nus-S Tag-EGFP,雖然在同濃度下,其熒光活性相對(duì)EGFP-CS較弱,但隨濃度增加,可以在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到其熒光活性逐漸增強(qiáng),這表明大分子物質(zhì)對(duì)穿膜肽的穿膜作用具有一定的影響,但依然可有效對(duì)其進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。將不同穿膜肽作用于多種細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),穿膜肽CS和CS4具有相對(duì)的廣譜性,但對(duì)于所選用的MKN和A549兩種細(xì)胞,其穿膜效率較差,因此穿膜作用可能具有組織特異性。比較多種人源性穿膜肽的穿膜效率,以篩選出高效、低毒的人源性穿膜肽作為藥物蛋白的穿膜載體,實(shí)現(xiàn)其藥理效果,研究表明,多種人源性的穿膜效肽具有較高的穿膜效率,可應(yīng)用于臨床醫(yī)藥。
【關(guān)鍵詞】：穿膜肽 TAT 人源性 EGFP
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：Q51;R329.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 引言9-20
• 1.1 細(xì)胞穿膜肽的發(fā)展9-10
• 1.2 細(xì)胞穿透肽：多功能的生物分子運(yùn)輸載體10-11
• 1.3 細(xì)胞穿膜肽的分類(lèi)11-12
• 1.4 細(xì)胞穿膜肽的攝入方式及機(jī)制研究12-14
• 1.5 影響細(xì)胞攝入機(jī)制的因素14
• 1.6 細(xì)胞穿透肽運(yùn)輸寡核苷酸14-16
• 1.7 細(xì)胞穿透肽的細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制16-20
• 第二章 材料和方法20-23
• 2.1 材料與儀器20-21
• 2.1.1 酶與生物試劑20
• 2.1.2 培養(yǎng)基配方20
• 2.1.3 大腸桿菌菌株及質(zhì)粒20
• 2.1.4 動(dòng)物細(xì)胞20
• 2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)基20
• 2.1.6 儀器與設(shè)備20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.2.1 寡核苷酸鏈與表達(dá)載體的重組構(gòu)建21
• 2.2.2 融合蛋白的表達(dá)純化21
• 2.2.3 Ni-NTA Agarose柱層析純化21
• 2.2.4 爬片制備21-22
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)22
• 2.2.6 其他22-23
• 第三章 穿膜肽CS和CS4的穿膜機(jī)理研究23-47
• 3.1 穿膜肽CS、CS4和TAT相關(guān)融合蛋白的構(gòu)建及表達(dá)純化23-29
• 3.1.1 融合蛋白EGFP-CS、EGFP-CS4和EGFP-TAT的純化23-25
• 3.1.2 融合蛋白TAT-mCherry的構(gòu)建及表達(dá)純化25-29
• 3.2 穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用時(shí)間依賴(lài)性29-30
• 3.3 穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用濃度依賴(lài)性30-33
• 3.3.1 激光共聚焦觀察穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用濃度依賴(lài)性30-32
• 3.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用的濃度依賴(lài)性32-33
• 3.4 不同抑制劑對(duì)穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用的影響33-36
• 3.5 穿膜肽CS攜帶大分子量貨物蛋白的穿膜作用36-41
• 3.5.1 重組質(zhì)粒pET43.1-egfp-cs的構(gòu)建36-39
• 3.5.2 融合蛋白Nus-S Tag-EGFP-CS的表達(dá)及純化39-40
• 3.5.3 融合蛋白Nus-S Tag-EGFP-CS對(duì)細(xì)胞穿膜作用實(shí)驗(yàn)40-41
• 3.5.4 結(jié)論41
• 3.6 穿膜肽CS內(nèi)吞途徑研究41-42
• 3.7 穿膜肽CS、CS4和TAT穿膜作用的細(xì)胞特異性42-47
• 3.7.1 穿膜肽CS、CS4和TAT對(duì)HeLa細(xì)胞穿膜活性比較42-43
• 3.7.2 穿膜肽CS、CS4和TAT對(duì)Bcap細(xì)胞穿膜活性比較43-44
• 3.7.3 穿膜肽CS、CS4和TAT對(duì)A549細(xì)胞穿膜活性比較44
• 3.7.4 穿膜肽CS、CS4和TAT對(duì)MKN細(xì)胞穿膜活性比較44
• 3.7.5 穿膜肽CS、CS4和TAT對(duì)OK細(xì)胞穿膜活性比較44-45
• 3.7.6 穿膜肽CS、CS4和TAT對(duì)CHO細(xì)胞穿膜活性比較45-46
• 3.7.7 結(jié)論46-47
• 第四章 不同人源性穿膜肽穿膜作用比較47-59
• 4.1 不同人源性穿膜肽重組質(zhì)粒的構(gòu)建47-50
• 4.1.1 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-tctp的構(gòu)建47-48
• 4.1.2 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-arf的構(gòu)建48
• 4.1.3 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-bagp的構(gòu)建48
• 4.1.4 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-cyt c的構(gòu)建48
• 4.1.5 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-hclock的構(gòu)建48
• 4.1.6 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-hct的構(gòu)建48-49
• 4.1.7 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-hlf的構(gòu)建49
• 4.1.8 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-hph的構(gòu)建49
• 4.1.9 重組質(zhì)粒pET28a-egfp-nrtn的構(gòu)建49-50
• 4.2 不同人源性穿膜肽融合EGFP蛋白的表達(dá)50-55
• 4.2.1 融合蛋白EGFP-TCTP的表達(dá)50
• 4.2.2 融合蛋白EGFP-ARF的表達(dá)50-51
• 4.2.3 融合蛋白EGFP-BagP的表達(dá)51-52
• 4.2.4 融合蛋白EGFP-Cyt c的表達(dá)52
• 4.2.5 融合蛋白EGFP-hClock的表達(dá)52-53
• 4.2.6 融合蛋白EGFP-hCT的表達(dá)53-54
• 4.2.7 融合蛋白EGFP-hLF的表達(dá)54
• 4.2.8 融合蛋白EGFP-Hph的表達(dá)54-55
• 4.2.9 融合蛋白EGFP-NRTN的表達(dá)55
• 4.3 各人源性穿膜肽融合蛋白EGFP的純化55-56
• 4.4 各人源性穿膜肽對(duì)cos-7細(xì)胞穿膜作用比較56-58
• 4.5 結(jié)論58-59
• 第五章 總結(jié)59-60
• 5.1 穿膜肽CS和CS4的穿膜機(jī)制研究59
• 5.2 穿膜肽CS和CS4對(duì)細(xì)胞特異性的研究59
• 5.3 穿膜肽攜帶大分子量物質(zhì)的穿膜效率研究59
• 5.4 不同人源性穿膜肽的穿膜作用比較59-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 致謝63

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1 陳，

本文編號(hào)：868686