本文關(guān)鍵詞：抗3-硝基酪氨酸單克隆抗體的制備、鑒定與應(yīng)用研究

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【摘要】：3-硝基酪氨酸（3NT）是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中的一種硝基化修飾產(chǎn)物，非常穩(wěn)定，常在病理狀態(tài)下伴隨活性氧和活性氮的增加而產(chǎn)生，與炎癥、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等至少50種疾病關(guān)系緊密，被公認(rèn)是體內(nèi)活性氮的重要生物標(biāo)志物。目前，3NT的檢測(cè)主要采用HPLC及GC-MS等方法，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比免疫檢測(cè)方法如ELISA、WB等具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單而且靈敏度高和可選擇性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)日益受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。 本研究的目的是制備抗3-硝基酪氨酸（3NT）單克隆抗體（McAb），為與3NT相關(guān)疾病的研究提供基礎(chǔ)。通過(guò)戊二醛法合成3-硝基酪氨酸人工抗原：3硝基酪氨酸-戊二醛-雞卵白蛋白（3NT-G-OVA）。經(jīng)BCA測(cè)定其濃度，紫外掃描法，聚丙烯酰胺電泳法（SDS-PAGE）對(duì)人工抗原進(jìn)行檢測(cè)。將其作為免疫原，皮下注射免疫BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)方法融合并經(jīng)間接ELISA法篩選，制備穩(wěn)定分泌抗3NT單克隆抗體的克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)，，并對(duì)McAb的亞類、效價(jià)、親和力及識(shí)別抗原特異性進(jìn)行鑒定與分析，獲得抗3NT單克隆抗體。收集糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝硬化病人血標(biāo)本，將抗3NT單克隆抗體初步應(yīng)用于Western blotting檢測(cè)樣本的硝基化水平。同時(shí)用生物素標(biāo)記制備的抗3NT單抗，作為包被于酶標(biāo)板的第一抗體，過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記抗CTX-II多肽抗體作為第二抗體（POD-58-3），初步建立雙抗體夾心ELISA法并進(jìn)行了臨床應(yīng)用檢測(cè)RA病人血清樣本。 1.成功合成了人工抗原3NT-G-OVA，測(cè)得其偶聯(lián)率為5.4。 2.成功獲得了1株穩(wěn)定分泌抗3NT單抗的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2F6，單抗亞類試劑盒測(cè)定2F6的重鏈為IgG2a亞類；間接ELISA測(cè)定其腹水效價(jià)為1:6.14×10~6；單抗親和力常數(shù)為7.81×10~7(M-1)；競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定2F6可特異性識(shí)別3NT。 3.制備了一株具有較高免疫活性和特異性的抗3NT單克隆抗體，并成功用于糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎以及肝硬化病人的硝基化蛋白水平的Western Blotting檢測(cè)。 4.夾心ELISA法檢測(cè)RA病人血清樣本測(cè)得的OD值比正常人高。成功的將抗3NT抗體臨床應(yīng)用，初步建立了夾心ELISA法，檢測(cè)RA病人血清樣本。 5.提高了58-3抗體特異性識(shí)別CTX-II的靈敏度，為軟骨降解產(chǎn)物CTX-II提供了一種新的檢測(cè)方法。
【關(guān)鍵詞】：戊二醛法 3-硝基酪氨酸 單克隆抗體 鑒定 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-11
• 第一章 引言11-17
• 1.1 蛋白硝基化概述11-13
• 1.2 蛋白硝基化與疾病的關(guān)系13-16
• 1.2.1 3NT 與糖尿病13-14
• 1.2.2 3NT 與動(dòng)脈粥樣硬化14
• 1.2.3 3NT 與神經(jīng)退行性疾病14
• 1.2.4 3NT 與高血壓14-15
• 1.2.5 3NT 與感染性休克15
• 1.2.6 3NT 與其它疾病15-16
• 1.3 3NT的檢測(cè)現(xiàn)狀與本課題的研究目的16-17
• 第二章 免疫原的合成與鑒定17-28
• 2.1 材料與方法17-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 2.2 結(jié)果與分析21-25
• 2.2.1 顏色判定21
• 2.2.2 紫外光譜法鑒定人工抗原21
• 2.2.3 SDS-PAGE 電泳21-22
• 2.2.4 卵白蛋白含量與偶聯(lián)率測(cè)定22-23
• 2.2.5 抗血清效價(jià)測(cè)定與競(jìng)爭(zhēng)抑制23-25
• 2.3 討論25-27
• 2.4 小結(jié)27-28
• 第三章 單克隆抗體的制備與鑒定定28-50
• 3.1 材料與方法28-37
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料28-31
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法31-37
• 3.2 結(jié)果37-46
• 3.2.1 小鼠免疫結(jié)果37
• 3.2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立及篩選37
• 3.2.3 腹水的制備與純化37-39
• 3.2.4 單克隆抗體類、亞類的測(cè)定39-40
• 3.2.5 單克隆抗體特異性40-43
• 3.2.6 單克隆抗體效價(jià)43-44
• 3.2.7 單克隆抗體親和力常數(shù)測(cè)定44-46
• 3.3 結(jié)論46-49
• 3.4 小結(jié)49-50
• 第四章 單抗的初步應(yīng)用-Western blot 檢測(cè)50-58
• 4.1 材料與方法50-53
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 4.2 結(jié)果與分析53-56
• 4.2.1 POD-Ab 濃度測(cè)定53
• 4.2.2 POD-Ab ELISA 鑒定53-54
• 4.2.3 最佳抗原和抗體的濃度確定54
• 4.2.4 POD-Ab 應(yīng)用于 Western blot54-56
• 4.3 討論56-57
• 4.4 小結(jié)57-58
• 第五章 單抗的初步應(yīng)用-夾心 ELISA 法的建立58-66
• 5.1 材料與方法58-61
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 5.2 結(jié)果與分析61-64
• 5.2.1 生物素標(biāo)記抗體（Bio-2F6）濃度的測(cè)定61
• 5.2.2 包被抗體（Bio-2F6）與酶標(biāo)二抗（POD-58-3）最佳工作濃度的確定61-62
• 5.2.3 夾心 ELISA 法的初步建立62-64
• 5.3 討論64-65
• 5.4 小結(jié)65-66
• 第六章 全文總結(jié)66-69
• 致謝69-70
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的研究成果74

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：866610