本文關(guān)鍵詞：新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV_△TK_△N1L-RFP對小鼠4T1乳腺癌模型的治療作用

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【摘要】：背景 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率已上升至女性惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。隨著現(xiàn)代手術(shù)技術(shù)的提高以及化療、放療等輔助治療手段的應(yīng)用，乳腺癌患者的總體生存率得到了改善，但是每年仍有30%-40%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者死亡[1-3]。因此，在臨床研究中迫切需要尋找一種有效的乳腺癌治療手段。腫瘤靶向性溶腫瘤病毒（Tumour-targeted oncolytic virus，TOVS）是目前惡性腫瘤研究的新熱點，其原理在于溶瘤病毒可以特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，進(jìn)而溶解腫瘤細(xì)胞，而這種溶瘤作用對正常細(xì)胞無影響[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)TOV可通過多重作用機制來發(fā)揮抗腫瘤效果，包括直接溶解細(xì)胞、表達(dá)毒性蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、深入誘導(dǎo)抗腫瘤免疫以及關(guān)閉宿主蛋白合成等，正是病毒治療機制的多樣性，國際上越來越多的研究者開始把目光轉(zhuǎn)移到溶瘤病毒治療方面來[6-7]。最近研究發(fā)現(xiàn)痘苗病毒N1L蛋白是引起神經(jīng)毒性的重要因素，同時該基因產(chǎn)物可通過與IKK復(fù)合物的靶向結(jié)合來抑制NF-kB和IRF3活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而拮抗宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[8-10]。因此，N1L的刪除不僅可增加TOV安全性，更重要的是增強機體對其更強的免疫反應(yīng)，，有可能增強其抗腫瘤效果。我們實驗室在VV△TK（在野生型Lister痘苗病毒的基礎(chǔ)上敲除Tymidine Kinase（TK）基因的病毒株）的基礎(chǔ)上敲除N1L基因來降低病毒毒性，同時并期望能夠激起機體更強的免疫反應(yīng)。本研究通過體外、體內(nèi)對比研究該病毒對小鼠4T1乳腺癌的治療效果和生物安全性。 目的 探討新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP及VV△TK對小鼠4T1乳腺癌的治療作用。 方法 第一部分：溶瘤病毒的制備及鑒定，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法檢測溶瘤痘苗病毒TK及N1L基因的刪除； 第二部分：體外，檢測溶瘤病毒對4T1細(xì)胞毒性，即采用MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium）法檢測新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對照痘苗病毒VV△TK對BALB/c小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1的殺傷作用，計算其EC50值（即殺死50%細(xì)胞所需要的病毒量）；采用TCID50(Tissue culture infective dose50%)法檢測新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對照痘苗病毒VV△TK在乳腺癌細(xì)胞株4T1中的復(fù)制能力； 第三部分：體內(nèi)實驗，通過建立小鼠4T1乳腺原位及轉(zhuǎn)移模型，檢測新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對照痘苗病毒VV△TK對其治療效果。 結(jié)果 第一部分：病毒制備成功，并且最高滴度可達(dá)1011pfu/ml,病毒經(jīng)過PCR檢測證實，溶瘤痘苗病毒VV△TK基因序列中TK基因被刪除，新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP基因序列中TK及N1L基因被刪除。 第二部分：在體外研究中，新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP的EC50平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（1.90±0.1）pfu/cell，對照痘苗病毒VV△TK的EC50平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（7.18±2.2）pfu/cell，說明VV△TK△N1L-RFP對4T1細(xì)胞的殺傷作用比VV△TK明顯增強(P＜0.05)。新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP感染4T1乳腺癌細(xì)胞后，不同時間點（24h、48h、72h）的病毒復(fù)制量分別為：30.89pfu/cell、43.04pfu/cell、43.95pfu/cell，對照病毒VV△TK感染4T1乳腺癌細(xì)胞后，不同時間點（24h、48h、72h）的病毒復(fù)制量分別為：36.87pfu/cell、52.19pfu/cell、60.91pfu/cell，說明兩種腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒均能在4T1細(xì)胞中復(fù)制，但兩者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 第三部分：在體內(nèi)研究方面，分別成功建立了小鼠4T1乳腺癌原位模型、小鼠4T1乳腺癌自發(fā)轉(zhuǎn)移模型和小鼠4T1乳腺癌術(shù)后自發(fā)轉(zhuǎn)移模型。通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)：手術(shù)前瘤內(nèi)分別注射新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP、對照痘苗病毒VV△TK和空白對照PBS，小鼠4T1乳腺腫瘤體積的縮小雖然沒有明顯差別，但是經(jīng)過新型溶腫瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP治療過的小鼠手術(shù)后生存時間得到了明顯延長。 結(jié)論 新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對照痘苗病毒VV△TK體外對小鼠4T1乳腺癌均有很好的殺傷效果，手術(shù)前使用VV△TK△N1L-RFP比對照痘苗病毒VV△TK顯示更強的抗腫瘤效果，可能為如何減低乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和延長生存率提供了一種新的治療方法。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 4T1 病毒治療 溶瘤痘苗病毒
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.9;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 中英文縮略詞11-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-27
• 結(jié)果27-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 綜述 溶瘤病毒治療乳腺癌的研究進(jìn)展40-59
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 個人簡歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文59-60
• 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：859747