本文關(guān)鍵詞：中國(guó)西南地區(qū)貓?jiān)垂蜗x株基因分型及毒力研究

  更多相關(guān)文章： 弓形蟲 基因分型 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 毒力

【摘要】：目的研究流行于我國(guó)西南地區(qū)（貴陽(yáng)）貓?jiān)垂蜗x株基因型分布及其毒力。探討其與中國(guó)其他地區(qū)有無(wú)遺傳差異，以及分離株對(duì)不同品系小鼠的毒力。 方法從中國(guó)西南地區(qū)（貴陽(yáng)）收集貓的標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)物接種，分離蟲株，收集小鼠腹水中的速殖子進(jìn)行提取DNA，經(jīng)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），，在SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1和Apico十個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型；反應(yīng)總體積為50μl，其中PCR master mix25μl、上下游引物各1μl、DNA模板1.5μl。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，60℃退火60s，72℃延伸90s，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，每管取5μl PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）的1%瓊脂糖凝膠中100V電泳30min，并在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。然后各管余下PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切。酶切后產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，0.5μg/ml溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳圖譜，并與參考蟲株圖譜進(jìn)行對(duì)比。經(jīng)PBS稀釋的純化速殖子按1103個(gè)/只腹腔感染SPF級(jí)KM，BALB/c，C57BL，ICR小鼠，每組10只。逐日觀察小鼠狀態(tài)并計(jì)算死亡率和存活時(shí)間，進(jìn)行毒力分析。 結(jié)果采用10個(gè)遺傳位點(diǎn)，從貴陽(yáng)分離出2株弓形蟲株，經(jīng)PCR-RFLP分析揭示了1個(gè)基因型（ToxoDB#9, China1）�；蛐虲hina1型在SAG2、GRA6、L358、PKl、c22-8位點(diǎn)為基因II型；在SAG3、BTUB、c29-2位點(diǎn)為基因III型；在Apico位點(diǎn)為基因I型。BALB/c、C57BL、KM、ICR四個(gè)品系雌鼠各10只，經(jīng)腹腔接種1×103個(gè)CT-1蟲株速殖子。C57BL小鼠感染后第5天開始出現(xiàn)豎毛、腹水、抽搐等明顯癥狀甚至死亡，第6天完全死亡。BALB/c小鼠在第5、6、7這三天之內(nèi)全部死亡。KM小鼠感染后6-7天，活動(dòng)減少，出現(xiàn)弓背、豎毛等癥狀，第10天死亡2只小鼠，感染后第15天至觀察45天結(jié)束，小鼠恢復(fù)正�；顒�(dòng)，一直存活。ICR小鼠相對(duì)于BALB/c、C57BL小鼠癥狀輕微，在第10、14天分別死亡了2只和1只小鼠，其余的在45天內(nèi)存活。存活的感染小鼠45天后頸椎脫臼處死，腦組織壓片發(fā)現(xiàn)有大量包囊形成。通過進(jìn)行不同品系小鼠毒力研究顯示：CT-1蟲株感染C57BL、BALB/c、KM、ICR小鼠死亡率有顯著差異（P＜0.01），C57BL、BALB/c小鼠兩者之間及KM、ICR小鼠兩者之間對(duì)蟲株無(wú)顯著差異（P＞0.01）。 結(jié)論雖然從世界各地人體和動(dòng)物體內(nèi)分離得到的蟲株的基因分型結(jié)果顯示，各地剛地弓形蟲具有豐富的遺傳多態(tài)性。然而中國(guó)大陸蟲株的基因分型結(jié)果與歐洲、非洲和北美的3個(gè)優(yōu)勢(shì)克隆株系截然不同：流行中國(guó)的動(dòng)物源性弓形蟲分離株具有有限的遺傳多樣性，弓形蟲China1為其優(yōu)勢(shì)基因型；在生物多樣性較為豐富的我國(guó)西南地區(qū)（貴陽(yáng)），China1型（ToxoDB#9）為其優(yōu)勢(shì)基因型，流行我國(guó)的弓形蟲分離株具有有限的遺傳多態(tài)性；該型CT-1蟲株對(duì)不同品系小鼠的致死力具有顯著性差異。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 基因分型 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 毒力
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.5
【目錄】：

• 英文縮略詞匯表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-12
• 2 材料與方法12-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料12-16
• 2.1.1 組織樣本12
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)準(zhǔn)蟲株12-13
• 2.1.3 PCR 引物及內(nèi)切酶13
• 2.1.4 引物的稀釋與儲(chǔ)存13-14
• 2.1.5 部分試劑14
• 2.1.6 部分試劑的配制14-15
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)所用儀器與設(shè)備15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 2.2.1 貓?jiān)葱怨蜗x的分離16
• 2.2.2 腹水基因組 DNA 提取16-17
• 2.2.3 目的基因擴(kuò)增17-23
• 2.2.4 1%瓊脂糖凝膠23
• 2.2.5 PCR 產(chǎn)物的酶切23-26
• 2.2.6 2.5%瓊脂糖凝膠26-27
• 2.2.7 酶切產(chǎn)物結(jié)果分析27
• 2.2.8 小鼠的毒力27
• 2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 弓形蟲基因分型27-28
• 3.2 小鼠毒力28-29
• 4 討論29-32
• 5 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 附一37-38
• 附二38-39
• 附三（綜述）39-47
• 參考文獻(xiàn)45-47

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：857219