本文關(guān)鍵詞：新型磷酯酰絲氨酸受體Tim-3介導凋亡細胞吞噬關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的研究

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【摘要】：研究背景 吞噬細胞吞噬凋亡細胞是機體清除衰老細胞及受損細胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制。凋亡細胞清除障礙在多種自身免疫病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡時,磷酯酰絲氨酸(PtdSer, PS)從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到表面,暴露在細胞外環(huán)境中,繼而被吞噬細胞表面的磷脂酰絲氨酸受體(PSR)識別并介導吞噬凋亡細胞,同時引起抗炎細胞因子(如TGF-β等)的釋放。而未被清除的凋亡細胞會積聚誘發(fā)”二次壞死”,細胞質(zhì)膜破裂釋放出大量內(nèi)容物,如核小體碎片、DNA、蛋白質(zhì)、組蛋白成分,引發(fā)炎癥反應及自身免疫性疾病。因此,對于新型PSR結(jié)構(gòu)與功能的研究成為目前的研究熱點。 吞噬細胞表面PSR識別磷酯酰絲氨酸是凋亡細胞吞噬過程中的關(guān)鍵。Masafumi等發(fā)現(xiàn)Tim-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule-3)可以介導凋亡細胞的吞噬,是一種新型磷脂酰絲氨酸受體。Tim-3是Ⅰ型跨膜糖蛋白,人與鼠Tim-3分子氨基酸序列含有63%的同源性,均包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(IgV)、含糖基化位點的粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Mucin domain)、跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain)及含酪氨酸磷酸化基序的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Cytoplasmic tail)。研究發(fā)現(xiàn),小鼠Tim-3分子IgV結(jié)構(gòu)域的CC'及FG環(huán)能識別磷酯酰絲氨酸,是吞噬細胞吞噬凋亡細胞的重要步驟,且小鼠Tim-3分子IgV結(jié)構(gòu)域中112位點精氨酸位點(R112)突變?yōu)楸彼?A)后(R112A)能抑制Tim-3與凋亡細胞的結(jié)合,提示該位點在Tim-3介導的凋亡細胞吞噬中具有關(guān)鍵性作用。與體外實驗結(jié)果相符,動物實驗證實,小鼠Tim-3能促進體內(nèi)凋亡細胞的清除；阻斷性Tim-3mAb處理導致自身免疫病模型小鼠脾淋巴結(jié)凋亡細胞及血清anti-dsDNA的增多；且高表達Tim-3的小鼠CD8+DC不僅促進凋亡細胞的吞噬,還增加對CD8+T細胞的交叉遞呈作用并抑制炎癥反應。上述研究強烈提示Tim-3在凋亡細胞的清除、抑制自身免疫病的發(fā)生及維持免疫耐受中發(fā)揮重要作用。然而,人Tim-3(hTim-3)介導凋亡細胞吞噬的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么,其功能結(jié)構(gòu)域及內(nèi)部信號機制迄今尚未見報道。 研究目的 構(gòu)建能有效表達主要結(jié)構(gòu)域缺失及點突變的人Tim-3(hTim-3)真核表達載體,轉(zhuǎn)染及吞噬實驗確定Tim-3介導凋亡細胞吞噬的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,為闡明Tim-3介導吞噬凋亡細胞機制、尋找相關(guān)自身免疫病潛在治療靶點提供理論基礎(chǔ)。 研究方法及結(jié)果1.成功建立可以有效表達主要功能域缺失及點突變的hTim-3真核表達載體 以本實驗室保存質(zhì)粒pcDNA3-hTim-3為模板,設計引物,PCR擴增Tim-3相應片段目的基因,經(jīng)HindⅡ、XhoⅠ酶切回收后,克隆入pcDNA3相應位點,構(gòu)建含HA-tag融合基因的各種人Tim-3(hTim-3)表達載體。構(gòu)建載體包括人Tim-3全長(hTim-3-FL)、IgV區(qū)缺失(△IgV)、粘蛋白功能域缺失(△mucin)、胞內(nèi)段缺失(△cyto)、胞內(nèi)段截短T1(aa1-aa277)、T2(aal-aa264)及主要酪氨酸磷酸化位點點突變(R111A、Y265F、Y272F、Y265/272F)載體。上述載體經(jīng)雙酶切及測序鑒定證實構(gòu)建成功。 利用lipo2000將上述載體DNA轉(zhuǎn)染至對數(shù)期生長的HEK293細胞,48h后收集細胞,分別抽提RNA及總蛋白,RT-PCR及Western blot檢測目的基因表達。RT-PCR結(jié)果顯示各載體均介導相應片段Tim-3mRNA在HEK293細胞表達。HA抗體Western blot結(jié)果證實所有載體均可介導不同長度Tim-3-HA融合蛋白表達；Tim-3抗體Western blot結(jié)果顯示,除△mucin外,各載體轉(zhuǎn)染后的HEK293細胞中均出現(xiàn)兩條特異性條帶,推測分子量大的一條為糖基化修飾蛋白。 2.成功建立凋亡細胞吞噬體系 2.1地塞米松誘導胸腺細胞凋亡 分離4到6周齡BALB/c鼠胸腺細胞,以1X107/ml細胞種于6孔板,在不含血清的DMEM培養(yǎng)基條件下加入10μM地塞米松(Dex)處理4h誘導凋亡收取細胞,3000rpm×5min,PBS洗滌兩次,以Annexin V及PI染色后檢測凋亡率。流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松(Dex)成功誘導胸腺細胞凋亡,早期凋亡率為(46.53±4.18)%,顯著高于對照組(P0.01)。 2.2以HEK293細胞為模型成功建立凋亡細胞吞噬體系 同上制備凋亡細胞,以0.1μg/ml PHrodo-SE標記后按20：1的比例與轉(zhuǎn)染hTim-3-FL載體的HEK293細胞共孵育90min。之后胰酶消化細胞并離心,以300μlCHES-FACS buffer重懸,分別進行熒光顯微鏡觀察及流式檢測。熒光顯微鏡觀察顯示,hTim-3-FL過表達HEK293細胞可以有效吞噬凋亡細胞,吞噬后凋亡細胞因酸性環(huán)境顯紅色熒光,而未被吞噬的凋亡細胞因PH7沒有熒光,提示,以HEK293細胞為模型成功建立了吞噬凋亡細胞體系,且轉(zhuǎn)染hTim-3-FL使得HEK293細胞增強了吞噬凋亡細胞的能力。流式檢測結(jié)果驗證了上述結(jié)果：轉(zhuǎn)染空載體(pcDNA3) HEK293細胞只能吞噬少量凋亡細胞,而過表達hTim-3-FL的HEK293細胞能夠有效吞噬凋亡細胞,吞噬率達到38%以上,二者相比有顯著性差異(P0.01)。 3.hTim-3分子介導吞噬凋亡細胞功能域的確定 為確定人Tim-3(hTim-3)蛋白中介導吞噬凋亡細胞的關(guān)鍵功能域,分別將構(gòu)建的不同功能域缺失及突變hTim-3表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞,同上與PHrodo-SE標記的凋亡細胞孵育后,流式細胞術(shù)測定HEK293吞噬凋亡細胞能力,分析hTim-3功能域?qū)ν淌傻蛲黾毎挠绊?結(jié)果如下： 3.1缺失IgV或Mucin結(jié)構(gòu)域的hTim-3失去促吞噬功能 hTim-3缺失胞外段結(jié)構(gòu)域IgV(ΔIgV)或mucin (△mucin)之后,其吞噬率分別為(8.85±2.93)%、(2.77±2.54)%,與對照組(3.44±2.96)%相比無統(tǒng)計學意義。 3.2R111位點是hTim-3促吞噬作用的關(guān)鍵位點 文獻報道,小鼠Tim-3分子的R112位點能夠識別磷酯酰絲氨酸(PtdSer)[15]。與此相符,人Tim-3相應R111位點突變后(R111A),其吞噬率與對照組相比無統(tǒng)計學意義。提示hTim-3蛋白的R111是識別PtdSer的主要位點。 3.3aa265-aa277是hTim-3胞內(nèi)段的有效功能片段 hTim-3胞內(nèi)段含有6個酪氨酸位點(Y227、Y265、Y272、Y280、Y281、Y283),為研究酪氨酸位點在Tim-3介導的凋亡細胞吞噬中的作用,構(gòu)建胞內(nèi)段截短載體——△cyto (aal-aa224)、T1(aal-aa277)、T2(aal-aa264),同上轉(zhuǎn)染HEK293細胞,構(gòu)建凋亡細胞吞噬體系。結(jié)果顯示,與hTim-3-FL相比,△cyto介導的凋亡細胞吞噬率顯著降低(P0.01)；但T1介導的凋亡細胞吞噬率與hTim-3-FL相似(P0.05),T2介導的凋亡細胞吞噬率則與△cyto無顯著差異。結(jié)果提示,hTim-3胞內(nèi)段在Tim-3介導的凋亡細胞吞噬中發(fā)揮重要作用,且胞內(nèi)段有效功能片段為aa265-aa277。 3.4凋亡細胞吞噬過程中發(fā)生了hTim-3胞內(nèi)段的酪氨酸磷酸化 為研究酪氨酸磷酸化在hTim-3介導的凋亡細胞吞噬中的作用。收集與凋亡細胞共孵育的hTim-3-FL或△cyto過表達HEK293細胞蛋白,anti-hTim-3抗體免疫沉淀后,磷酸化酪氨酸抗體(anti-PY)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),與hTim-3-FL轉(zhuǎn)染組相比,Δcyto轉(zhuǎn)染組磷酸化酪氨酸水平明顯減少。提示酪氨酸的磷酸化參與Tim-3介導的凋亡細胞吞噬。3.5Tim-3介導的凋亡細胞吞噬需要其胞內(nèi)Y265及Y272的協(xié)同作用 aa265-aa277是hTim-3介導凋亡細胞吞噬的關(guān)鍵胞內(nèi)片段,其中包含兩個酪氨酸磷酸化位點(Y265及Y272),分別對上述位點進行單獨突變及聯(lián)合突變(Y265F、Y272F、Y265/272F)并比較其介導的凋亡細胞吞噬率。結(jié)果顯示,兩個酪氨酸磷酸化位點單獨突變(Y265F及Y272F)并不影響hTim-3介導的對凋亡細胞的吞噬功能；而聯(lián)合突變Y265/272F則明顯減弱了hTim-3介導的對凋亡細胞的吞噬能力(P0.05),但Y265/272F聯(lián)合突變組吞噬凋亡細胞率仍顯著高于△cyto組(P0.05)。提示hTim-3介導的凋亡細胞吞噬需要其胞內(nèi)Y265及Y272位點協(xié)同作用,且除酪氨酸磷酸化外,推測其它氨基酸位點修飾同樣參與Tim-3介導的凋亡細胞吞噬信號傳導。 4.hTim-3介導的凋亡細胞吞噬不依賴于ELMO/Dock180/Rac及GULP通路 文獻顯示,磷酯酰絲氨酸受體介導凋亡細胞吞噬的信號傳導主要通過兩條經(jīng)典通路：ELMO/Dock180/Racl及胞漿接頭蛋白GULP,兩條通路最終均活化Racl引起細胞骨架重排以吞噬凋亡細胞。然而RT-PCR檢測并未發(fā)現(xiàn)HEK293細胞中有通路分子ELMO的表達,且用GULP siRNA干擾后并不影響hTim-3及△cyto介導的凋亡細胞吞噬率。提示Tim-3介導的凋亡細胞吞噬作用并不依賴于經(jīng)典的ELMO/Dock180/Racl及GULP通路,其具體通路尚有待于進一步研究。結(jié)論 1.成功構(gòu)建了不同截短片段及突變的hTim-3系列表達載體,為深入研究Tim-3結(jié)構(gòu)與功能提供了重要實驗材料。 2.成功建立凋亡細胞吞噬體系,為下一步的功能驗證奠定了實驗基礎(chǔ)。 3.證實人Tim-3分子的胞外段結(jié)構(gòu)域尤其是R111位點在識別凋亡細胞并介導凋亡細胞吞噬中發(fā)揮重要作用；胞內(nèi)aa265-aa277片段是hTim-3介導吞噬凋亡細胞的關(guān)鍵胞內(nèi)功能片段,且Tim-3介導吞噬凋亡細胞依賴于其胞內(nèi)Y265及Y272的磷酸化及協(xié)同作用。 4.hTim-3介導凋亡細胞吞噬的信號傳導不依賴于經(jīng)典的ELMO/Dock180/Racl及GULP途徑。 創(chuàng)新性和意義 凋亡細胞的吞噬是目前研究熱點。Tim-3作為一種新型的PtdSer受體,在巨噬細胞及DC細胞中高表達,參與多種免疫性疾病發(fā)生。因此,研究Tim-3促凋亡細胞吞噬的機制具有重要意義。本課題首次證實了人Tim-3分子在介導凋亡細胞吞噬過程中的功能結(jié)構(gòu)域,為自身免疫病潛在治療靶點的選擇提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：Tim-3 磷酯酰絲氨酸受體 凋亡 吞噬 信號傳導
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 目錄4-5
• CATALOGUE5-6
• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-17
• 符號說明17-19
• 前言19-23
• 材料23-29
• 方法29-44
• 結(jié)果44-60
• 討論60-64
• 參考文獻64-69
• 附錄69-72
• 致謝72-73
• 發(fā)表文章73-74
• 學位論文評閱及答辯情況表74

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