本文關(guān)鍵詞：白念珠菌ORF19.2734和ORF19.3222基因功能研究

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【摘要】：白念珠菌是臨床常見的條件致病真菌，由于抗細(xì)菌藥物的濫用，免疫缺陷病人增加等因素，使得真菌感染的發(fā)病率逐漸上升。因此針對白念珠菌的研究也越來越被臨床重視。白念珠菌的致病力與其應(yīng)對外界刺激，如藥物、金屬離子等方面密不可分。本課題選取了ORF19.2734等8個白念珠菌應(yīng)激相關(guān)基因，通過同源重組的方法構(gòu)建基因缺失菌來研究這些基因的功能。最終成功構(gòu)建了ORF19.2734的基因缺失菌。通過Spots assay、生長曲線、激光共聚焦顯微鏡、菌絲誘導(dǎo)等方法考察其表型。類似于高等真核生物中的溶酶體，液泡是真菌和植物中特有的一種細(xì)胞器，能夠在真菌細(xì)胞中發(fā)揮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、輸送營養(yǎng)、維持菌絲形成能力和致病力等多方面的作用。液泡同時也能夠?qū)φ婢?xì)胞應(yīng)對外界刺激起到重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了液泡相關(guān)基因ORF19.3222的基因缺失菌，通過研究其表型推測其為液泡膜上的硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本課題同時使用ORF19.3222的基因缺失菌，進(jìn)一步考察基因ORF19.3222的功能。通過透射電鏡、激光共聚焦顯微鏡等方法考察基因缺失菌的細(xì)胞壁完整性；通過羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)、測定細(xì)胞麥角甾醇含量等考察基因缺失菌對唑類藥物敏感性的改變的原因；通過考察對SO2、甲硫氨酸、半胱氨酸的敏感性考察其參與細(xì)胞硫的代謝途徑。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用表達(dá)譜芯片技術(shù)，分析和推測該基因的生物學(xué)功能。 第一部分結(jié)果表明液泡相關(guān)基因ORF19.2734敲除后可以提高菌株對唑類藥物的敏感性，會導(dǎo)致菌株生長的減緩，但是對菌絲形成能力和液泡的形態(tài)不造成影響。通過實(shí)時定量PCR的方法，推測ORF19.2734基因可能通過下調(diào)MDR1、ERG11、ERG2基因，增加胞內(nèi)藥物濃度、降低Erg11p活性，從而提高對氟康唑的敏感性。 第二部分結(jié)果表明液泡相關(guān)基因ORF19.3222缺失菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，甘露糖層變薄，葡聚糖層暴露增加，這些使得基因缺失菌更容易被巨噬細(xì)胞識別吞噬，造成毒力的下降。ORF19.3222缺失后在20min內(nèi)細(xì)胞的外排增加，胞內(nèi)麥角甾醇的含量降低，對SO2、半胱氨酸、甲硫氨酸敏感性增加，延遲細(xì)胞代謝產(chǎn)生H2S。表達(dá)譜芯片的結(jié)果與前期多次實(shí)時定量PCR的結(jié)果有相互印證，如硫轉(zhuǎn)運(yùn)通路中基因MET16表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞表面GPI錨定蛋白PGA23表達(dá)上調(diào)、ALS9表達(dá)下調(diào)等，同時芯片結(jié)果還提示該基因與液泡膜上V-ATPase的活性有密切的關(guān)系。V-ATPase是維持細(xì)胞內(nèi)部pH穩(wěn)態(tài)的重要蛋白，V-ATPase活性的下降可以導(dǎo)致液泡pH的升高、菌絲形成能力下降等方面；同時，，細(xì)胞內(nèi)麥角甾醇含量減少也會降低液泡膜V-ATPase活性，進(jìn)而提高菌株對唑類藥物的敏感性。ORF19.3222基因缺失菌在氟康唑刺激下，V-ATPase功能增強(qiáng)，體現(xiàn)在液泡酸化程度增加，編碼V-ATPase亞基的基因VMA2、VMA13表達(dá)量上升；在無氟康唑刺激下，沒有明顯的差異。提示ORF19.3222基因缺失菌對唑類藥物敏感性降低是由于V-ATPase活性的增強(qiáng)造成的。因此推測在白念珠菌液泡膜上硫轉(zhuǎn)運(yùn)途徑與H+轉(zhuǎn)運(yùn)之間有密切的關(guān)聯(lián)。 結(jié)論：ORF19.2734基因缺失菌通過下調(diào)MDR1、ERG11、ERG2基因提高了對氟康唑的敏感性。ORF19.3222基因?qū)S持正常的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、維持毒力有重要作用。ORF19.3222基因參與細(xì)胞內(nèi)硫以及含硫氨基酸的代謝過程，會影響細(xì)胞內(nèi)V-ATPase的正�；钚裕瑥亩鴮�(dǎo)致對唑類藥物敏感性的降低。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 液泡 硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 V-ATPase
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R379;R3416
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略詞表9-10
• 前言10-12
• 第一部分、液泡相關(guān)基因 ORF19.2734 功能研究12-25
• 一、實(shí)驗(yàn)材料與方法12-18
• 二、結(jié)果18-24
• 三、討論24-25
• 第二部分、液泡相關(guān)基因 ORF19.3222 功能研究25-54
• 一、實(shí)驗(yàn)材料與方法25-30
• 二、結(jié)果30-49
• 三、討論49-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 附 1 綜述59-70
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 附 2 在讀期間發(fā)表的文章70-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

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1 康燁;閻瀾;姜遠(yuǎn)英;;白假絲酵母菌對宿主的應(yīng)激反應(yīng)[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2013年03期

2 姚響文;曹穎瑛;姜遠(yuǎn)英;;模式識別受體在白念珠菌感染中的作用[J];中國真菌學(xué)雜志;2013年01期

本文編號：854532