發(fā)布時(shí)間：2017-09-14 23:00

  本文關(guān)鍵詞：利用高通量測(cè)序技術(shù)研究電磁輻射加速秀麗線蟲發(fā)育的分子機(jī)制及PCR擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低規(guī)律的析因分析

  更多相關(guān)文章： 電磁輻射 秀麗線蟲 高通量測(cè)序 雙重PCR 擴(kuò)增效率 復(fù)性效率

【摘要】：隨著通信技術(shù)的迅猛發(fā)展，電力設(shè)備的廣泛應(yīng)用，家用電器的大量普及，生活環(huán)境中的電磁場(chǎng)(electromagnetic fields，EMF)急劇增加，對(duì)于公眾的身心健康具有潛在的威脅。流行病調(diào)查結(jié)果顯示，電磁輻射能夠引起人類神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的功能異常。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，高強(qiáng)度的電磁輻射能夠?qū)ι矬w造成廣泛的損傷效率，如熱效率和非熱效應(yīng)。因此，電磁輻射對(duì)生物體的損傷效應(yīng)及其分子機(jī)制的研究已經(jīng)成為生物電磁學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。目前，電磁輻射生物損傷效應(yīng)的研究取得了長足進(jìn)步，但是電磁輻射生物效應(yīng)的分子機(jī)制至今尚未闡明，嚴(yán)重影響了電磁輻射防護(hù)藥物的研發(fā)以及相關(guān)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)和措施的制定，成為生物電磁學(xué)亟待解決的重要問題。本實(shí)驗(yàn)室為探討電磁輻射生物效應(yīng)的分子機(jī)制，建立了秀麗線蟲的電磁輻射體系。前期研究結(jié)果表明，持續(xù)電磁輻射能夠顯著加速秀麗線蟲的發(fā)育速度。因此，本研究在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)線蟲的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜和microRNA表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序分析，旨在篩選出線蟲體內(nèi)應(yīng)答電磁輻射的靶基因和信號(hào)通路，揭示持續(xù)電磁輻射加速線蟲發(fā)育的分子機(jī)制，從而為電磁輻射生物效應(yīng)的分子機(jī)制研究提供新的思路和方向。此外，在運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescencequantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)技術(shù)和雙重PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果的可靠性時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效率(amplification efficiency，Ea)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)中的一個(gè)重要參數(shù)，與PCR的實(shí)際應(yīng)用密切相關(guān)。因此，對(duì)PCR擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的原因進(jìn)行了深入探討。主要研究結(jié)果如下： 一、利用高通量測(cè)序技術(shù)研究電磁輻射加速線蟲發(fā)育的分子機(jī)制 目的：利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選秀麗線蟲應(yīng)答電磁輻射的靶基因和信號(hào)通路，闡明持續(xù)電磁輻射加速秀麗線蟲發(fā)育的分子機(jī)制，并探討電磁輻射加速線蟲發(fā)育的生物效應(yīng)中是否存在非熱效應(yīng)。方法：根據(jù)電磁輻射組(1.75GHz，110V/m，20℃)，陰性對(duì)照組(20℃)和溫度對(duì)照組(25℃)線蟲的生長曲線，挑選4個(gè)樣品(電磁組36h，溫度對(duì)照組36h，陰性對(duì)照組36h和陰性對(duì)照組48h)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和microRNA組測(cè)序，，然后采用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較電磁組36h與溫度對(duì)照組36h樣品之間差異表達(dá)的基因和microRNA，同時(shí)分析電磁組36h樣品中特異表達(dá)基因及其功能。 結(jié)果：電磁組36h與溫度對(duì)照組36樣品之間共存在372個(gè)上調(diào)基因和18個(gè)下調(diào)基因，20個(gè)上調(diào)microRNA和16個(gè)下調(diào)microRNA；電磁組36h樣品中共存在630個(gè)特異性表達(dá)的基因，主要參與線蟲的表皮發(fā)育和蛻皮等生理過程；參與線蟲體內(nèi)Hedgehog信號(hào)通路的基因如grl-5，grl-7，wrt-1，ptr-18，ptr-16，wrt-2，grd-1在電磁組36h樣品中特異性高表達(dá)，并且受到miR-230，miR-56和miR-57的負(fù)調(diào)控。 結(jié)論：電磁輻射加速秀麗線蟲發(fā)育的生物效應(yīng)中存在非熱效應(yīng)。電磁輻射可能是通過促進(jìn)膠原及蛻皮相關(guān)基因的表達(dá)，從而加速線蟲的發(fā)育。 二、雙重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析結(jié)果 目的：將雙重PCR與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，建立一種驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的新方法。 方法：根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析結(jié)果，挑選8個(gè)差異基因作為靶基因，分別使用雙重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳、雙重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，比較三者的驗(yàn)證率。結(jié)果：雙重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳的驗(yàn)證率為50%；雙重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的驗(yàn)證率均為100%。 結(jié)論：雙重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳可作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證的一種有效方法。 三、PCR擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的原因分析 目的：揭示PCR擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的原因 方法：首先引入模板復(fù)性效率(renaturation efficiency，Er)表征模板復(fù)性反應(yīng)(template renaturation reaction，TRR)發(fā)生的能力，并分析復(fù)性效率在整個(gè)反應(yīng)過程中的變化規(guī)律；從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度，分析PCR反應(yīng)和模板復(fù)性反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)力以及兩者競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系在整個(gè)反應(yīng)過程的變化規(guī)律，從理論上探討模板復(fù)性是否為擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的主要原因；采用Q-PCR技術(shù)研究模板濃度對(duì)擴(kuò)增效率曲線和復(fù)性效率曲線的影響規(guī)律，從實(shí)驗(yàn)角度論證模板復(fù)性是否為擴(kuò)增效率呈“S”形曲線降低的主要原因；探討PCR平臺(tái)期產(chǎn)生的原因，確定引物耗竭，底物耗竭，酶活性喪失以及酶活性飽和等因素是否為擴(kuò)增效率降低降低的主要原因。 結(jié)果：模板復(fù)性效率在整個(gè)反應(yīng)過程中的變化規(guī)律為“S”形曲線；理論分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，模板復(fù)性是擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的主要原因是；在PCR反應(yīng)的平臺(tái)期，引物和底物并未耗竭，聚合酶沒有飽和并保持較高活性，模板發(fā)生強(qiáng)烈復(fù)性。 結(jié)論：模板復(fù)性是擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的主要原因，同時(shí)也是PCR平臺(tái)期形成的主要原因。
【關(guān)鍵詞】：電磁輻射 秀麗線蟲 高通量測(cè)序 雙重PCR 擴(kuò)增效率 復(fù)性效率
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R383.1
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-18
• 第一章 利用高通量測(cè)序技術(shù)研究電磁輻射加速線蟲發(fā)育的分子機(jī)制1418-33
• 1.1 材料與方法18-25
• 1.2 結(jié)果25-30
• 1.3 討論30-33
• 第二章 雙重 PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析結(jié)果33-43
• 2.1 材料與方法34-37
• 2.2 結(jié)果37-41
• 2.3 討論41-43
• 第三章 PCR 擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低規(guī)律的析因分析43-66
• 第一節(jié) 模板復(fù)性是擴(kuò)增效率呈倒“S”形曲線降低的主要原因44-55
• 3.1.1 材料與方法44-46
• 3.1.2 結(jié)果46-55
• 第二節(jié) 模板復(fù)性是 PCR 平臺(tái)期形成的主要原因55-66
• 3.2.1 材料與方法56-61
• 3.2.2 結(jié)果61-66
• 討論66-69
• 全文總結(jié)69-71
• 參考文獻(xiàn)71-80
• 附錄一 英文縮略詞表80-81
• 附錄二 主要溶液的配制81-83
• 附錄三 主要儀器設(shè)備83-84
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表或投稿的文章和專利85-86
• 致謝86-87
• 綜述87-100
• 參考文獻(xiàn)98-100

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號(hào)：852812