本文關鍵詞：我國部分地區(qū)艱難梭菌PCR-核糖體分型及毒素基因多態(tài)性研究

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【摘要】：目的了解我國4個地區(qū)艱難梭菌PCR-核糖體型別的分型情況,并獲得該4個地區(qū)艱難梭菌臨床株A、B毒素基因序列,分析其基因多態(tài)性特征,了解不同型別菌株的tcdA、tcdB序列遺傳特征,并探討可能的進化特征。同時將A、B毒素基因多態(tài)性與PCR-核糖體分型結合分析,尋找合適位點,為深入開展流行病學調查、溯源、建立適用于我國的分子檢測方法提供依據。方法選取4個地區(qū)的104株難梭菌臨床分離株,分別為北京、廣東、山東、河南,進行毒素基因分型、PCR-核糖體分型后,從genBank下載艱難梭菌630(A+B+菌株)和M68(A-B+菌株)的基因做為模板,對tcdA、tcdB進行引物設計、sanger測序基因全長。測序結果使用DNA序列拼裝軟件進行序列拼裝,得到測序重疊群(contigs),再以艱難梭菌630和M68為模板,確定基因起始點和終止點。對獲得的50株艱難梭菌的tcdA、tcdB序列,進行數據分析,包括：PCR-核糖體型別分類、序列堿基比對、統計堿基差異數、多態(tài)性分析(SNP)、進化分析、流行病與統計學分析。結果此次研究我們成功的獲取了104株來自中國4個不同地區(qū)的臨床艱難梭菌的PCR-核糖體型別,共分20個型別。我國菌株基因遺傳特征與歐美不同,研究中收集到部分地區(qū)的菌株顯示以RT017為優(yōu)勢菌株(21.15%),其次為RT046/043(15.53%),RT001(14.56%)。同時還獲得了不同型別代表菌株tcdA和tcdB序列,共50個tcdA、50個tcdB序列。分析結果發(fā)現,A、B基因多態(tài)性明顯。tcdA序列的非同義突變SNP和堿基缺失主要發(fā)生在受體結合區(qū),提示該區(qū)經歷過激烈的正進化選擇壓力。tcdB序列沒有發(fā)現大片段堿基缺失的現象,但是其SNP明顯高于tcdA,且菌株間的突變率也要大于tcdA,進化速率更快,其非同義突變SNP集中于glucosyltransferase domain和auto-protease domain。這種現象提示,毒素基因或整個PaLoc區(qū)存在基因重組或HGT,有利于進化中的菌株保存其優(yōu)勢基因序列。經過分析,PCR-核糖體型別與毒素基因序列間存在著一定的聯系,如如12株RT001的序列組合均為A05804,11株RT017中9株為A11807,9株RT046/043中7株為A02802,3株RT012均為A08801。結論我國部分地區(qū)艱難梭菌臨床菌株的PCR-核糖體型以RT017為主(21.15%),其次為RT046/043(15.53%),RT001(14.56%),且型別存在一定的地域性分布,北京、廣東以RT017為流行株,河南以RT046/043為流行株,山東以RT001為流行株,這提示應針對不同的地區(qū)建立相應的檢測方法。艱難梭菌毒素型以A+B+為主,且A、B基因變異度高,具有多態(tài)性；tcdA:SNP和大片段堿基序列缺失主要發(fā)生在3’端的受體結合區(qū);tcdB:SNP高于tcdA,主要發(fā)生在葡糖基轉移酶區(qū)。本研究對A、B基因序列組合與PCR-核糖體分型進行初步探討分析,發(fā)現存在著一定相對應的關系,如如12株RT001的序列組合均為A05804,11株RT017中9株為A11807,9株RT046/043中7株為A02802,3株RT012均為A08801。提示可以建立一種既能反應毒素情況,又能顯示菌株PCR-核糖體型別的分型方法,這對于我國快速檢測和治療艱難梭菌都有重要意義。
【關鍵詞】：艱難梭菌 tcdA tcdB PCR-核糖體分型 毒素基因序列
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英文縮略語7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-26
• 1. 實驗菌株來源15
• 2. 主要試劑和儀器15-16
• 3. 主要軟件16
• 4. 艱難梭菌分離培養(yǎng)16
• 5. 艱難梭菌生化鑒定16-17
• 6. 提取測序菌株全基因組DNA及分子生物學鑒定17-19
• 7. 毒素基因的檢測19-20
• 8. PCR-核糖體分型20
• 9. Sanger測序tcdA和tcdB20-23
• 10. 艱難梭菌tcdA和tcdB序列數據分析23
• 11. 用promage試劑盒提取艱難梭菌全基因組DNA23-26
• 實驗結果26-35
• 1. 菌株來源及分型26-29
• 2. 菌株A、B毒素序列分析29-33
• 2.1 A毒素序列分析29-30
• 2.2 B毒素序列分析30-31
• 2.3 毒素序列進化分析31-32
• 2.4 部分菌株未測序成功原因分析32-33
• 3. PCR-核糖體型別與A、B毒素序列關系33-35
• 討論35-39
• 結論39-40
• 參考文獻40-44
• 綜述44-54
• 參考文獻50-54
• 附錄54-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士學位期間獲獎及發(fā)表的學術論文61-62

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