本文關(guān)鍵詞：基于胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)神經(jīng)分化模型評價bFGF對神經(jīng)發(fā)育作用的影響

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【摘要】：目的: 建立小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞離體實驗?zāi)Ｐ停接懖煌瑵舛鹊膲A性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）對小鼠神經(jīng)發(fā)育過程的影響。 方法: (1)將ESC形成的EB使用5×10~(-7)mol/L維甲酸（ratinoic acid，RA）進行懸浮誘導(dǎo)2天，之后換用ITS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)OG2小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)向神經(jīng)細(xì)胞定向分化，并通過形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光和定量PCR等方法，用于ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化的鑒定；(2)將ESC來源的神經(jīng)細(xì)胞暴露于不同濃度的bFGF和VPA15天后，用CCK8法檢測測定物bFGF和陽性對照藥物丙戊酸（valproic acid, VPA）的神經(jīng)毒性作用；(3)將ESC來源的神經(jīng)細(xì)胞暴露于不同濃度的bFGF15天后，Q-PCR定量分析法檢測測定物bFGF和VPA對神經(jīng)特異性標(biāo)記基因表達的影響，并用蛋白印記方法驗證Q-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性；(4)將ESC來源的神經(jīng)細(xì)胞暴露于不同濃度的bFGF15天后，流式細(xì)胞術(shù)和Hoechost染色等方法測定bFGF在非細(xì)胞毒性劑量下對神經(jīng)分化細(xì)胞凋亡等影響。 結(jié)果: （1）成功建立胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的模型。形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光和定量PCR等方法用于ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化的鑒定結(jié)果表明，所誘導(dǎo)分化形成的神經(jīng)細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞特征，可用于bFGF神經(jīng)作用及其毒性的實驗研究。 （2）驗證神經(jīng)細(xì)胞定向分化模型用于評價待測物神經(jīng)發(fā)育毒性的有效性。用所建立神經(jīng)細(xì)胞定向分化模型，檢測已知胚胎毒性藥物丙戊酸（VPA）對已分化神經(jīng)細(xì)胞的毒性及ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過程神經(jīng)組織特異性基因的影響，以驗證所建立的干細(xì)胞神經(jīng)誘導(dǎo)分化模型的可用性。結(jié)果表明，VPA的IC_(50)=103μg/mL，對神經(jīng)組織特異性基因影響的結(jié)果與文獻研究結(jié)果類似，表明該誘導(dǎo)分化模型可用于神經(jīng)發(fā)育毒性的檢測。 （3）bFGF對小鼠胚胎干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育過程的影響。用所建立的神經(jīng)細(xì)胞分化模型，檢測bFGF對神經(jīng)發(fā)育過程的影響，結(jié)果表明，bFGF的IC_(50)=9.6μg/mL；0.1μg/mL bFGF可誘導(dǎo)神經(jīng)元分化和成熟；1μg/mLbFGF主要促進神經(jīng)前體細(xì)胞的生長，，提高mES-NPC的增殖能力；10μg/mL bFGF為促進神經(jīng)元細(xì)胞的生長。在所試驗濃度范圍內(nèi)，未見對神經(jīng)分化細(xì)胞造成明顯毒性表現(xiàn)。 （4）所用劑量bFGF未發(fā)現(xiàn)具有誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷毒性。 結(jié)論: 本研究建立小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ�，探討不同濃度的bFGF對小鼠神經(jīng)發(fā)育過程的影響。研究結(jié)果表明，bFGF在0.1-10μg/mL范圍內(nèi)，主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)神經(jīng)元分化和成熟，增強mESC-NPC的增殖能力，以及促進神經(jīng)元細(xì)胞的生長。未見到bFGF對神經(jīng)細(xì)胞的明顯毒性，表明bFGF在常用濃度條件和高劑量下使用相對安全。
【關(guān)鍵詞】：堿性成纖維生長因子（bFGF） 小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC） 丙戊酸（VPA） 神經(jīng)發(fā)育 神經(jīng)毒性
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 目錄7-10
• 第一章 前言10-20
• 1. ESC 定向誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的方法10-13
• 1.1 擬胚體培養(yǎng)法(EB culture method)11-12
• 1.2 共培養(yǎng)法(coculture method)12
• 1.3 單層培養(yǎng)法(monoculture method)12-13
• 2. ESC 定向分化為神經(jīng)細(xì)胞模型用于神經(jīng)毒理的評價13-14
• 3. 神經(jīng)特異性標(biāo)記物的研究現(xiàn)狀14-16
• 3.1 巢蛋白(Nestin)14
• 3.2 成對盒蛋白 6 (Paired box protein 6, Pax-6)14-15
• 3.3 微管相關(guān)蛋白(Microtubule-associated protein, MAP)15
• 3.4 微管蛋白(Tubulin)15
• 3.5 神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament protein, NF)15
• 3.6 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)15-16
• 4. bFGF 的生物學(xué)活性16-17
• 4.1 bFGF 廣泛的生物學(xué)活性16
• 4.2 bFGF 神經(jīng)誘導(dǎo)作用的研究進展16-17
• 5. 研究目的及技術(shù)路線17-20
• 5.1 立體依據(jù)17-18
• 5.2 擬研究內(nèi)容18-19
• 5.3 技術(shù)路線圖19-20
• 第二章 材料與方法20-31
• 1. 實驗儀器和材料20-25
• 1.1 實驗動物20
• 1.2 細(xì)胞系20
• 1.3 實驗儀器20-21
• 1.4 實驗材料21-22
• 1.5 主要試驗溶液的配制22-25
• 2. 實驗方法25-31
• 2.1 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定和分化25-26
• 2.2 細(xì)胞免疫熒光染色分析26-27
• 2.3 CCK8 測定 bFGF 和 VPA 的細(xì)胞毒性（IC50）27
• 2.4 神經(jīng)細(xì)胞特異性基因表達分析27-29
• 2.5 細(xì)胞總蛋白的制備和免疫印跡29-30
• 2.6 碘化丙啶（propidium iodide）檢測細(xì)胞凋亡30
• 2.7 Hoechst 33342 檢測細(xì)胞凋亡30
• 2.8 細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化應(yīng)激蛋白的測定30
• 2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計30-31
• 第三章 實驗結(jié)果31-48
• 1 胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞模型的建立31-38
• 1.1 ESC 未分化的鑒定31-32
• 1.2 神經(jīng)誘導(dǎo)分化程序及結(jié)果32-33
• 1.3 RA 最佳誘導(dǎo)濃度的確定33-34
• 1.4 免疫熒光檢測神經(jīng)前體細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白34-35
• 1.5 免疫熒光檢測神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白35
• 1.6 RT-PCR 測定分化各個時期特異性標(biāo)記基因35-36
• 1.7 Q-PCR 檢測未分化特異性標(biāo)記基因的表達36-38
• 2 不同濃度的 bFGF 對神經(jīng)誘導(dǎo)過程的影響38-41
• 2.1 形態(tài)學(xué)觀察不同濃度的 bFGF 對神經(jīng)誘導(dǎo)過程的影響38-39
• 2.2 bFGF 對 ESC 來源神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用（IC50）39
• 2.3 bFGF 對 ESC 分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中冠狀結(jié)構(gòu)的影響39-40
• 2.4 驗證神經(jīng)細(xì)胞定向分化模型用于評價待測物神經(jīng)發(fā)育毒性的有效性40-41
• 3 不同濃度 bFGF 對胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)記基因和蛋白的影響41-44
• 3.1 bFGF 對神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記基因表達的影響41-44
• 3.2 bFGF 對神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白表達的影響44
• 4 bFGF 對神經(jīng)細(xì)胞分化過程中抑制凋亡和氧化應(yīng)激作用44-48
• 4.1 bFGF 對神經(jīng)細(xì)胞分化過程中細(xì)胞凋亡率的影響44-46
• 4.2 bFGF 對神經(jīng)細(xì)胞分化過程中細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察46
• 4.3 不同濃度 bFGF 對神經(jīng)分化細(xì)胞培養(yǎng)基中氧化應(yīng)激水平的影響46-48
• 第四章 討論48-53
• 4.1 胚胎干細(xì)胞定向分化神經(jīng)細(xì)胞模型的建立及 bFGF 的作用48-49
• 4.2 VPA 用于驗證神經(jīng)誘導(dǎo)分化模型的有效性49
• 4.3 bFGF 胚胎干細(xì)胞來源神經(jīng)細(xì)胞的擴增、分化的影響49-51
• 4.4 毒性相關(guān)神經(jīng)特異性標(biāo)記物的篩選51
• 4.5 bFGF 胚胎毒性與神經(jīng)毒性作用的關(guān)系51-53
• 結(jié)論53-54
• 展望54-55
• 參考文獻55-64
• 英文縮略詞表64-65
• 攻碩期間發(fā)表論文65-66
• bFGF 原液檢驗報告單66-67
• 致謝67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉曉陽,孫洪亮,湯繼文;堿性成纖維細(xì)胞生長因子對培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細(xì)胞的促進增殖作用[J];中國臨床康復(fù);2004年02期

本文編號：844542