本文關(guān)鍵詞：腸激安膠囊對(duì)IBS-D模型大鼠“腦腸軸異�！闭{(diào)控作用的分子機(jī)制及相關(guān)差異蛋白的分析

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【摘要】：目的： 探討腸激安膠囊對(duì)腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)模型大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)含量的影響；探討腸激安膠囊對(duì)IBS-D模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織NPY mRNA的表達(dá)和CGRP mRNA表達(dá)的影響；建立IBS-D模型組和對(duì)照組結(jié)腸組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜,結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定并分析差異表達(dá)蛋白,對(duì)候選表達(dá)差異蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)功能和相關(guān)研究,進(jìn)一步闡明IBS-D腦腸軸異常機(jī)制。 方法： (1)將SD大鼠隨機(jī)分為正常組,模型組,匹維溴銨組(0.018g/kg),腸激安膠囊高(2.812g/kg)、中(1.406g/kg)、低(0.703g/kg)劑量組,每組8只,模型組以及給藥組采用母乳分離+醋酸刺激+四肢束縛法制備IBS-D大鼠模型,各組按20mL/kg灌胃給藥,正常組和模型組給予等劑量的生理鹽水,連續(xù)給藥14天,采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中ACTH和CORT的含量。 (2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠下丘腦和結(jié)腸組織中NPY和CGRP mRNA的表達(dá)：取凍存組織,加液氮研磨后按每100mg組織加入1mL Trizol試劑,總RNA的提取按TRIzol試劑說明書進(jìn)行,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和含量。引物序列如下：NPY：上游5'-TTCAGCCACCCGAGAT-3',下游5'-GCTTATGACCCGCACTTA-3'; CGRP:上游5'-ATCCATAACATGACAGCATGG-3',下游5'-CAGTTCTTTAAGCATTGGTTCCA-3';內(nèi)參18S：上游5'-CGACACTACATCAATC-3',下游5'-ATACAACGACAACAAG-3'.熒光定量PCR總反應(yīng)體積25μL,反應(yīng)體系為：12.5μL SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix,前后引物各1μL,1μL cDNA,9.5μL ddH20。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s,55℃40s,72℃50s,共35個(gè)循環(huán)；最后72℃7min結(jié)束反應(yīng),運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組下丘腦和結(jié)腸組織中NPY和CGRP基因的相對(duì)表達(dá)量。 (3)采用雙向凝膠電泳法分離IBS-D模型組和正常對(duì)照組結(jié)腸差異蛋白,運(yùn)用MALDI TOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定,運(yùn)用Gene Ontology和Pathway Studio生物信息學(xué)方法將所鑒定的差異蛋白進(jìn)行功能分類,分析IBS-D病理機(jī)制中關(guān)鍵蛋白和涉及到的相關(guān)通路。 結(jié)果： (1)與正常對(duì)照組比較,IBS-D大鼠血清中ACTH含量明顯升高(P＜0.01),腸激安膠囊高、中劑量組均顯著降低大鼠血清中ACTH含量(P＜0.01)；與正常對(duì)照組比較,IBS-D大鼠血清中CORT含量明顯升高(P＜0.01),腸激安膠囊高、中劑量組均明顯降低大鼠血清中CORT含量(P＜0.05)；腸激安膠囊治療IBS-D的機(jī)制可能與下調(diào)HPA軸中ACTH和CORT含量有關(guān)。 (2)通過熒光定量PCR研究腸激安膠囊對(duì)IBS-D模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織中NPY mRNA和CGRP mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明,與正常對(duì)照組比較,IBS-D模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織中NPY mRNA表達(dá)明顯降低,腸激安膠囊高、中、低劑量均能明顯提高IBS-D模型大鼠下丘腦NPY mRNA的表達(dá),腸激安膠囊高、中劑量均能明顯提高IBS-D模型大鼠結(jié)腸NPY mRNA的表達(dá)；與正常對(duì)照組比較,IBS-D模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織中CGRP mRNA表達(dá)明顯增加,腸激安膠囊高、中劑量組均能明顯降低IBS-D模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織CGRP mRNA的表達(dá)。 (3)本研究首次運(yùn)用蛋白組學(xué)的方法尋找IBS-D模型組和正常對(duì)照組結(jié)腸的差異表達(dá)蛋白特征譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2.5倍以上的差異蛋白有15個(gè)：氯離子通道蛋白1(Chloride intracelluLar channel protein1, CLIC1);硫氧還蛋白(Thioredoxin, TRX);熱休克蛋白(10kDa heat shock protein, HSP10);細(xì)胞角蛋白8(Cytokeratin-8, CK8)前梯度同源蛋白2(anterior gradient homolog2, AGR2);肌動(dòng)蛋白輔助蛋白類似蛋白(Coactosin-like protein, COTL1);淋巴細(xì)胞胞漿蛋白1(lymphocyte cytosolic protein1, LCP1);蛋白質(zhì)磷酸酶2調(diào)節(jié)亞基1A(protein phosphatase2, reguLatory subunit A, PPP2R1A);烯醇化酶3(Enolase3);泛醇細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白I(Ubiquinolcytochrome c reductase core protein I, UQCRC1);泛醌NADH脫氫酶Fe-S蛋白1(NADH dehydrogenase Fe-S protein1, NDUFS1);細(xì)胞色素C氧化酶亞基5B(Cytochrome coxidase subunit5B, COX5B);二磷酸3核苷酸酶1(3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase1, BPNT1)。結(jié)論： 腸激安膠囊高中劑量組治療IBS-D的機(jī)制可能與下調(diào)IBS-D腦腸軸異常的機(jī)制中HPA軸ACTH和CORT的含量有關(guān)；腸激安膠囊對(duì)IBS-D大鼠腦腸軸異常機(jī)制有調(diào)節(jié)作用,其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)下丘腦和結(jié)腸組織NPY mRNA表達(dá)和下調(diào)下丘腦和結(jié)腸組織CGRP mRNA表達(dá)有關(guān)；熱休克蛋白、硫氧還蛋白、氯離子通道蛋白等可能是IBS-D腦腸軸異常機(jī)制中潛在分子標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：腸激安膠囊 腹瀉性腸易激綜合征 腦腸軸異常 蛋白組學(xué) 神經(jīng)肽Y 降鈣素基因相關(guān)肽 促腎上腺皮質(zhì)激素 皮質(zhì)酮 下丘腦 結(jié)腸
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R285.5;R-332
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 目錄8-11
• 前言11-13
• 第一章 腸易激綜合征“腦腸軸異�！睓C(jī)制及治療的研究進(jìn)展13-23
• 1 IBS“腦腸軸異�！睓C(jī)制13-15
• 1.1 五羥色胺及其受體14
• 1.2 神經(jīng)肽Y14-15
• 1.3 降鈣素基因相關(guān)肽15
• 1.4 HPA軸15
• 2 腸易激綜合征的治療15-22
• 2.1 腸易激綜合征的中藥治療16
• 2.2. 腸易激綜合征的西藥治療16-21
• 2.3 腸易激綜合征的針灸治療21
• 2.4 腸易激綜合征的心理治療21-22
• 2.5 腸易激綜合征的飲食治療22
• 3 總結(jié)22-23
• 第二章 腸激安膠囊對(duì)IBS-D模型大鼠血清中ACTH和CORT含量的影響23-30
• 1 引言23
• 2 材料與方法23-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)藥品23
• 2.3 造模方法與動(dòng)物分組23-24
• 2.4 模型的評(píng)估24
• 2.5 模型組和正常組大鼠下丘腦、結(jié)腸組織HE染色24
• 2.6 腸激安膠囊對(duì)IBS-D大鼠血清中ACTH含量的影響24-25
• 2.7 腸激安膠囊對(duì)IBS-D大鼠血清中CORT含量的影響25-26
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26
• 3 研究結(jié)果26-28
• 3.1 模型驗(yàn)證結(jié)果26
• 3.2 IBS-D模型組和正常對(duì)照組下丘腦和結(jié)腸組織HE染色結(jié)果26-27
• 3.3 腸激安膠囊對(duì)IBS-D大鼠血清中ACTH含量的影響27-28
• 3.4 腸激安膠囊對(duì)IBS-D大鼠血清中CORT含量的影響28
• 4 討論28-30
• 第三章 腸激安膠囊對(duì)IBS-D模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織NPY mRNA和CGRPmRNA表達(dá)的影響30-44
• 1 引言30
• 2 材料與方法30-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑30-31
• 2.2 主要儀器31
• 2.3 總RNA的提取31
• 2.4 RNA的逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA31-32
• 2.5 Real-time PCR的擴(kuò)增32-33
• 2.6 PCR產(chǎn)物的初步鑒定33
• 2.7 Real-time PCR反應(yīng)33-34
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理34
• 3 研究結(jié)果34-41
• 3.1 熒光定量PCR檢測(cè)NPY mRNA的表達(dá)34-38
• 3.2 熒光定量PCR檢測(cè)CGRP mRNA的表達(dá)38-41
• 4 討論41-44
• 第四章 IBS-D大鼠模型組和正常組結(jié)腸組織2-DE圖譜的建立及差異蛋白的鑒定44-62
• 1 引言44
• 2 材料與方法44-51
• 2.1 主要試劑44-45
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器45
• 2.3 生物信息學(xué)軟件45-46
• 2.4 主要溶液的配制46-47
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 2.6 2-DE步驟48-49
• 2.7 圖像掃描與分析49
• 2.8 差異表達(dá)蛋白的酶解49-50
• 2.9 質(zhì)譜鑒定50
• 2.10 差異表達(dá)蛋白的功能分類和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖50-51
• 3 研究結(jié)果51-60
• 3.1 Bradford法測(cè)定蛋白濃度51
• 3.2 IBS-D大鼠模型組和對(duì)照組結(jié)腸組織的2-DE結(jié)果51-53
• 3.3 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定53-54
• 3.4 差異蛋白的功能分類54-55
• 3.5 鑒定的差異蛋白的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖55-60
• 4 討論60-62
• 結(jié)語62-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 附錄72-80
• 在學(xué)期間參與課題、發(fā)表論文與獲獎(jiǎng)情況80-81
• 致謝81

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：841095