本文關(guān)鍵詞：基于NASBA技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌耐藥性方法的建立

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【摘要】：目的：產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌在世界各地的爆發(fā)威脅著人類的生命健康，而且攜帶KPC的細(xì)菌感染與高死亡率呈正相關(guān)。因此及時(shí)準(zhǔn)確快速的檢出產(chǎn)KPC細(xì)菌對(duì)預(yù)防、控制耐藥菌株的流行意義重大。推薦的改良Hodge試驗(yàn)準(zhǔn)確性高，但較費(fèi)時(shí)。PCR擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間大大縮短，但對(duì)儀器設(shè)備和場(chǎng)所要求較高。核酸序列依賴性擴(kuò)增NASBA具有操作簡(jiǎn)便、擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在建立檢測(cè)KPC耐藥的NASBA檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用依賴KPC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的NASBA擴(kuò)增檢測(cè)KPC耐藥。根據(jù)Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因KPC的保守序列設(shè)計(jì)NASBA引物，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序鑒定。同時(shí)摸索及優(yōu)化NASBA反應(yīng)中各酶濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度等條件，分析該方法的靈敏度和特異性。采用該NASBA方法、PCR及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)臨床收集的45株肺炎克雷伯菌，比較結(jié)果的一致性。 結(jié)果：KPC及MDH的NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分別得到249nt、190nt的特異性條帶，并且測(cè)序鑒定序列與預(yù)計(jì)片段序列比對(duì)一致。通過(guò)摸索及優(yōu)化NASBA反應(yīng)中各酶濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度等條件建立NASBA擴(kuò)增體系（24μl）：緩沖液中氯化鉀終濃度60mmol/L，，氯化鎂終濃度14mmol/L，PH8.0Tris-HCl終濃度40mmol/L，DTT終濃度7.5mmol/L，DMSO終濃度15%；每個(gè)引物終濃度0.2μmol/L；dNTP1mmol/L；NTP2mmol/L；酶混合液中T7RNA聚合酶50U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反應(yīng)溫度：40℃；反應(yīng)時(shí)間：90min。該NASBA方法能檢測(cè)到10-3ng/μl的RNA量，較RT-PCR方法多2個(gè)數(shù)量級(jí)，提示該方法比RT-PCR靈敏度高；對(duì)照KPC陰性菌株與KPC陽(yáng)性菌株的NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析發(fā)現(xiàn)僅KPC陽(yáng)性菌株出現(xiàn)特異性條帶。45株臨床收集的肺炎克雷伯菌中32株NASBA擴(kuò)增陽(yáng)性，13株NASBA擴(kuò)增陰性，與藥敏、PCR、RT-PCR結(jié)果一致，符合率達(dá)到100%。 結(jié)論：NASBA方法檢測(cè)KPC型碳青霉烯酶耐藥簡(jiǎn)便快速，并且靈敏度和特異性均較高，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：NASBA 耐藥 KPC基因
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.996
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第一部分 肺炎克雷伯菌 MDH NASBA 擴(kuò)增方法的建立14-32
• 1 材料14-15
• 1.1 菌株14
• 1.2 主要儀器及耗材14
• 1.3 主要試劑及配制方法14-15
• 1.3.1 主要試劑14-15
• 1.3.2 培養(yǎng)基配制15
• 1.3.3 NASBA 擴(kuò)增試劑配制15
• 2 方法15-19
• 2.1 NASBA 擴(kuò)增15-17
• 2.1.1 引物設(shè)計(jì)15-16
• 2.1.2 提取細(xì)菌 RNA16
• 2.1.3 NASBA 擴(kuò)增16-17
• 2.2 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定17
• 2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物17
• 2.2.2 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸測(cè)序、分析17
• 2.3 NASBA 擴(kuò)增條件的優(yōu)化17-19
• 2.3.1 NASBA 擴(kuò)增反應(yīng)溫度的優(yōu)化18
• 2.3.2 NASBA 擴(kuò)增時(shí)間的選擇18
• 2.3.3 NASBA 擴(kuò)增酶濃度的優(yōu)化18
• 2.3.3.1 NASBA 擴(kuò)增 T7 RNA 聚合酶最佳反應(yīng)濃度的選擇18
• 2.3.3.2 NASBA 擴(kuò)增 RNA 酶 H 最佳反應(yīng)濃度的選擇18
• 2.3.3.3 NASBA 擴(kuò)增 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶最佳反應(yīng)濃度的選擇18
• 2.3.4 NASBA 擴(kuò)增試劑濃度的優(yōu)化18-19
• 2.3.4.1 NASBA 擴(kuò)增氯化鉀濃度的優(yōu)化18
• 2.3.4.2 NASBA 擴(kuò)增氯化鎂濃度的優(yōu)化18-19
• 2.3.4.3 NASBA 擴(kuò)增 DTT 濃度的優(yōu)化19
• 3 結(jié)果19-29
• 3.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物19-20
• 3.2 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序、分析20-21
• 3.3 NASBA 擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化21-29
• 3.3.1 NASBA 擴(kuò)增反應(yīng)溫度的篩選21-22
• 3.3.2 NASBA 擴(kuò)增時(shí)間的選擇22-23
• 3.3.3 NASBA 擴(kuò)增酶濃度的優(yōu)化23-26
• 3.3.4 NASBA 擴(kuò)增試劑濃度的優(yōu)化26-29
• 4 小結(jié)與討論29-32
• 4.1 初步建立 NASBA 擴(kuò)增方法29
• 4.2 NASBA 檢測(cè)方法的建立29-30
• 4.3 NASBA 反應(yīng)條件對(duì)擴(kuò)增效率的影響30
• 4.4 NASBA 的優(yōu)勢(shì)30-32
• 4.4.1 高特異性30-31
• 4.4.2 高靈敏度31
• 4.4.3 高保真度31
• 4.4.4 應(yīng)用前景廣31-32
• 第二部分 肺炎克雷伯菌 KPC 的PCR 檢測(cè)及RT-PCR 檢測(cè)32-48
• 1 材料32-33
• 1.1 菌株32
• 1.2 主要儀器及耗材32
• 1.3 主要試劑32-33
• 2 方法33-36
• 2.1 藥敏分析判斷標(biāo)準(zhǔn)33
• 2.2 PCR 引物設(shè)計(jì)33
• 2.3 培養(yǎng)基的制備33-34
• 2.4 DNA 提取34
• 2.5 PCR 檢測(cè)34-35
• 2.5.1 PCR 反應(yīng)體系34-35
• 2.5.2 PCR 反應(yīng)參數(shù)35
• 2.5.3 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)35
• 2.6 RNA 提取35
• 2.7 RT-PCR 檢測(cè)35-36
• 2.7.1 RT-PCR 反應(yīng)體系35-36
• 2.7.2 RT-PCR 反應(yīng)條件36
• 2.7.3 RT-PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)36
• 2.8 特異性檢測(cè)36
• 2.9 靈敏度檢測(cè)36
• 3 結(jié)果36-47
• 3.1 藥敏分析結(jié)果36
• 3.2 KPC PCR 擴(kuò)增結(jié)果36-38
• 3.3 KPC RT-PCR 特異性檢測(cè)38-39
• 3.4 KPC RT-PCR 靈敏度檢測(cè)39-40
• 3.5 KPC RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果40-47
• 3.5.1 RNA 提取結(jié)果40-42
• 3.5.2 RNA 16s rDNA PCR 結(jié)果42-44
• 3.5.3 cDNA KPC PCR 結(jié)果44-47
• 4 小結(jié)與討論47-48
• 第三部分 肺炎克雷伯菌 KPC NASBA 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)與初步應(yīng)用48-64
• 1 材料48-50
• 1.1 菌株48
• 1.2 主要儀器及耗材48
• 1.3 主要試劑48-49
• 1.4 NASBA 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)49-50
• 2 方法50-51
• 2.1 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸測(cè)序、分析50
• 2.2 MDH 基因靈敏度及特異性實(shí)驗(yàn)50-51
• 2.2.1 MDH 基因靈敏度實(shí)驗(yàn)50
• 2.2.2 MDH 基因特異性實(shí)驗(yàn)50-51
• 2.3 KPC 基因靈敏度及特異性實(shí)驗(yàn)51
• 2.3.1 KPC 基因靈敏度實(shí)驗(yàn)51
• 2.3.2 KPC 基因特異性實(shí)驗(yàn)51
• 2.4 NASBA 方法的臨床初步應(yīng)用51
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析51
• 3 結(jié)果51-62
• 3.1 NASBA 擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸測(cè)序、分析51-52
• 3.2 MDH 基因靈敏度及特異性實(shí)驗(yàn)52-54
• 3.2.1 MDH 基因靈敏度實(shí)驗(yàn)52-53
• 3.2.2 MDH 基因特異性實(shí)驗(yàn)53-54
• 3.3 KPC 基因靈敏度及特異性實(shí)驗(yàn)54-56
• 3.3.1 KPC 基因靈敏度實(shí)驗(yàn)54-55
• 3.3.2 KPC 基因特異性實(shí)驗(yàn)55-56
• 3.4 NASBA 方法的臨床初步應(yīng)用56-62
• 3.4.1 NASBA 擴(kuò)增結(jié)果56-62
• 4 小結(jié)與討論62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 附錄A NASBA 技術(shù)在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用68-75
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 在學(xué)研究成果75-76
• 致謝76

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本文編號(hào)：837026