發(fā)布時(shí)間：2017-09-12 09:26

  本文關(guān)鍵詞：弓形蟲P30蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)及其誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的研究

  更多相關(guān)文章： 弓形蟲 P30 乳酸乳球菌 表達(dá) 口服疫苗

【摘要】：目的構(gòu)建弓形蟲昆山分離株P(guān)30基因的乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒L2Ps-P30-T，并在乳酸乳球菌中表達(dá)P30基因，然后用表達(dá)弓形蟲P30蛋白的乳酸乳球菌口服免疫小鼠，觀察表達(dá)弓形蟲P30蛋白的乳酸乳球菌所誘導(dǎo)小鼠的體液免疫、黏膜免疫水平及對(duì)弓形蟲感染的保護(hù)力。 方法以BamHI及XhoI限制性內(nèi)切酶將P30從構(gòu)建好的質(zhì)粒pSK-P30中切出并克隆至構(gòu)建好的質(zhì)粒pSK-PsT，構(gòu)建成pSK-Ps-P30-T質(zhì)粒，用PvuII限制性內(nèi)切酶將表達(dá)元件-Ps-P30-T-從pSK-Ps-P30-T質(zhì)粒中切出，用相同的酶切位點(diǎn)導(dǎo)入大腸桿菌和乳球菌穿梭質(zhì)粒pTRKL2，構(gòu)建成L2Ps-P30-T質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)將L2Ps-P30-T導(dǎo)入至乳酸乳球菌，用SDS-PAGE電泳和Western blotting鑒定P30在乳酸乳球菌中的表達(dá)。選用69只體重為（18±2）g健康雌性BALB/c小鼠，將小鼠隨機(jī)分組為疫苗免疫組、乳球菌對(duì)照組和生理鹽水組，每次每只小鼠分別飼喂5×109個(gè)的表達(dá)弓形蟲P30蛋白的乳酸乳球菌懸液、不含重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌懸液和等體積的生理鹽水。分別在喂食小鼠后第27、34及48天從小鼠尾靜脈采血、分離血清，用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測(cè)小鼠血清中IgG水平；在喂食小鼠后第48天每組殺死3只小鼠，分離小鼠的小腸黏液及脾細(xì)胞，檢測(cè)小腸黏液中的SIgA水平；培養(yǎng)脾細(xì)胞，檢測(cè)培養(yǎng)上清中INF-γ、IL-4和IL-10水平。同時(shí)第48天用弓形蟲灌胃感染每組剩下的其他小鼠（每組20只），感染后記錄小鼠的發(fā)病情況，計(jì)算小鼠死亡率，小鼠灌胃感染30d后解剖小鼠并統(tǒng)計(jì)小鼠肝、腦組織中的蟲體數(shù)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。 結(jié)果用酶切及PCR方法鑒定質(zhì)粒L2pS-P30-T構(gòu)建正確。SDS-PAGE電泳沒有檢測(cè)到P30蛋白的表達(dá)。但Western blotting檢測(cè)到乳球菌中表達(dá)能被弓形蟲病人血清識(shí)別的約30kDa蛋白。小鼠血清中抗P30IgG水平隨時(shí)間增高，小鼠血清中IgG水平疫苗免疫組與乳球菌對(duì)照組、生理鹽水組比較，其存在的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.01）。乳球菌對(duì)照組與生理鹽水組比較其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；小鼠小腸黏液中的SIgA水平疫苗免疫組與乳球菌對(duì)照組、生理鹽水組比較，，其存在的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。乳球菌對(duì)照組與生理鹽水組比較其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；弓形蟲灌胃感染后的小鼠肝、腦組織中蟲體數(shù)疫苗免疫組與乳球菌對(duì)照組、生理鹽水組比較，其存在的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。乳球菌對(duì)照組、生理鹽水組比較，其存在的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 結(jié)論 1弓形蟲昆山分離株P(guān)30基因的乳酸乳球菌表達(dá)載體質(zhì)粒L2pS-P30-T構(gòu)建正確。 2P30在乳酸乳球菌中得到了表達(dá)，但表達(dá)量低。 3表達(dá)弓形蟲P30蛋白的乳酸乳球菌可誘導(dǎo)小鼠的黏膜免疫和體液免疫，對(duì)弓形蟲感染能產(chǎn)生一定的保護(hù)力。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 P30 乳酸乳球菌 表達(dá) 口服疫苗
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.5;R392
【目錄】：

• 主要縮略語英文索引4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-14
• 一 實(shí)驗(yàn)材料14-17
• 1.材料14-15
• 2.儀器設(shè)備15-17
• 二 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖17-18
• 三 實(shí)驗(yàn)方法18-25
• 1.pSKPs-T，pSKP30 及 pTRKL2 質(zhì)粒 DNA 的小量制備18-19
• 2. BamHI/XhoI 分別雙酶切 pSKPs-T/pSKP30 質(zhì)粒及目的片斷的回收19
• 3. pSKPs-T 酶切產(chǎn)物與 P30 的連接反應(yīng)19
• 4.感受態(tài)細(xì)菌的制備19-20
• 5. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選20
• 6. pSKPs P30-T 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定20-21
• 8.pSKPs P30-T 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定21
• 9. PvuII 酶切 pSKPs P30-T/質(zhì)粒及大腸桿菌與乳球菌穿梭質(zhì)粒pTRKL2 及回收目的片段21
• 10. -Ps-P30-T-與 pTRKL2 的 PvuII 酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)21
• 11. 感受態(tài)制備，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選和重組質(zhì)粒抽提鑒定21
• 12. DNA 序列測(cè)定21
• 13. 乳球菌電轉(zhuǎn)化21-22
• 14. 挑取克隆抽提質(zhì)粒，PCR 及雙酶切鑒定22
• 15. P30 基因在乳球菌中的表達(dá)22
• 16. Western blotting 檢測(cè) P30 的表達(dá)22-23
• 17. 小鼠口服免疫方法23
• 18. 小鼠血清 IgG 檢測(cè)23
• 19. 小鼠小腸液 SIgA 的檢測(cè)23
• 20. 小鼠脾細(xì)胞獲取及培養(yǎng)23-24
• 21. 保護(hù)性實(shí)驗(yàn)24
• 22.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法24-25
• 四 結(jié)果25-34
• 五 討論34-37
• 六 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 附錄41-47
• 文獻(xiàn)綜述47-52
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 在讀期間科研成果52-54
• 致謝54

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李軼杰;劉歡歡;張富春;;乳酸乳球菌同時(shí)發(fā)送外源性蛋白質(zhì)/DNA到哺乳動(dòng)物細(xì)胞[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年12期

2 馮金;洪愉;毛普加;黃芬;井申榮;曾韋錕;;組成型表達(dá)人呼吸道合胞病毒F_(212-489)蛋白乳酸乳球菌的構(gòu)建[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年13期

3 孫強(qiáng)正;徐建國;;乳酸乳球菌食品級(jí)表達(dá)載體的研究進(jìn)展[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2006年03期

4 周紅,鄭江,魯永玲,秦孝建,肖光夏;抗菌蛋白葛栳紗在乳酸乳球菌中的表達(dá)研究[J];四川生理科學(xué)雜志;2001年03期

5 ;中華人民共和國衛(wèi)生部公告[J];中國食品衛(wèi)生雜志;2011年02期

6 孫強(qiáng)正;熊衍文;李振軍;孫暉;徐建國;;乳酸乳球菌食品級(jí)載體的構(gòu)建及Mn-SOD基因的克隆和表達(dá)[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2006年06期

7 劉方久;張德純;蒲榮;;大腸埃希菌Mn-SOD在乳酸乳球菌中的表達(dá)[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2007年06期

8 孫強(qiáng)正;熊衍文;葉長蕓;徐建國;;乳酸乳球菌食品級(jí)分泌性表達(dá)載體pSQZ的構(gòu)建及報(bào)告蛋白的表達(dá)[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2008年03期

9 張小娟;張榮光;段廣才;范清堂;;乳酸乳球菌NZ3900電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J];山東醫(yī)藥;2010年11期

10 吳潔;劉曉銳;楊雪;侯景;徐茂磊;申麗麗;黃東成;劉坤鋒;;重組HSP65-6P277乳酸乳球菌疫苗對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠的降糖作用[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張娟;傅瑞燕;李寅;陳堅(jiān);;谷胱甘肽在乳酸乳球菌酸脅迫和冷凍脅迫中的保護(hù)作用[A];中國生物工程學(xué)會(huì)第四次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2005年

2 張娟;傅瑞燕;陳堅(jiān);李寅;;谷胱甘肽在乳酸乳球菌酸脅迫中的保護(hù)作用[A];2006中國微生物學(xué)會(huì)第九次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

3 孫磊;孔文濤;孔健;;乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化條件的研究[A];山東微生物學(xué)會(huì)第六次會(huì)員代表大會(huì)暨2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上）[C];2004年

4 王秀麗;任曉冬;龍才;馬博宇;韓文瑜;;乳酸乳球菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[A];吉林省第六屆生命科學(xué)大型學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文集[C];2008年

5 傅瑞燕;陳堅(jiān);李寅;;外源谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶顯著提高乳酸乳球菌抗氧脅迫能力[A];中國生物工程學(xué)會(huì)第四次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2005年

6 梁小波;鐘瑾;還連棟;;納豆激酶基因在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)[A];第二屆中國青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

7 孔健;馬桂榮;;乳酸乳球菌中限制和修飾酶基因LlaBⅢ的克隆及分析[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識(shí)創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊(cè)）[C];2001年

8 付瑞燕;陳堅(jiān);李寅;;谷胱甘肽保護(hù)乳酸乳球菌SK11抵抗氧脅迫[A];2008年中國微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

9 王迎華;陳燕;高丹丹;曹郁生;;大腸桿菌galU基因在乳酸乳球菌中的克隆及對(duì)產(chǎn)胞外多糖的影響[A];2008年中國微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

10 龔芳紅;賀松;張德純;劉明方;郭亞楠;;幽門螺桿菌熱休克蛋白A在乳酸乳球菌中的表達(dá)及免疫學(xué)活性分析[A];重慶微生物學(xué)會(huì)第九屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 傅瑞燕;利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究[D];江南大學(xué);2006年

2 生舉正;透明質(zhì)酸合成途徑在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明質(zhì)酸分子量調(diào)控機(jī)制的初步研究[D];山東大學(xué);2009年

3 莊重;人β-干擾素和大腸桿菌O157：H7表面抗原EspA在乳酸乳球菌食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)體系中表達(dá)及相關(guān)免疫活性分析[D];山東大學(xué);2007年

4 汪川;可分泌高活性β-半乳糖苷酶的重組乳酸乳球菌株的構(gòu)建及其產(chǎn)酶特性的初步研究[D];四川大學(xué);2006年

5 徐毅;乳酸菌高效膜蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其自溶性質(zhì)的研究[D];山東大學(xué);2012年

6 胡春霞;大腸桿菌K88菌毛蛋白亞基FaeG重組乳酸乳球菌的構(gòu)建及其對(duì)ICR小鼠免疫保護(hù)的研究[D];浙江大學(xué);2009年

7 王振華;豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗的構(gòu)建及免疫原性評(píng)價(jià)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐海燕;不同地區(qū)自然發(fā)酵乳中乳酸乳球菌多位點(diǎn)序列分型研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 房杰;一株重組乳酸乳球菌抗氧脅迫機(jī)制的初探[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 秦艷青;乳酸乳球菌主要分泌蛋白的鑒定及其同源整合載體的構(gòu)建研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 雷雨婷;乳酸乳球菌中冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)及其抗凍保護(hù)作用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

5 尹尉翰;海藻酸鈣微囊對(duì)乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境中的保護(hù)作用[D];上海交通大學(xué);2009年

6 侯宏曉;乳鏈菌肽前體基因克隆及在乳酸乳球菌中的表達(dá)研究[D];西南農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

7 馬露;豬白介素-18和干擾素γ在乳酸乳球菌中的表達(dá)及生物活性的檢測(cè)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 黃潔潔;一株乳酸乳球菌重組菌株抗脅迫能力的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

9 易艷軍;弓形蟲P30蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)及其誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的研究[D];南華大學(xué);2013年

10 郭志偉;乳酸乳球菌ATCC11454高產(chǎn)乳鏈菌肽的遺傳育種[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：836393