本文關(guān)鍵詞：Necrostatin-1保護谷氨酸誘導的細胞死亡機制研究

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【摘要】：【研究背景和意義】：谷氨酸廣泛的參與了生物體能量代謝及神經(jīng)傳導的過程。維持正常生理功能十分重要的氨基酸。谷氨酸在體內(nèi)代謝功能的紊亂會引起多種疾病的發(fā)生。然而對其在體內(nèi)產(chǎn)生的毒性的具體機制研究還不是很清楚。 【研究目的】研究necrostatin-1與受體相互作用蛋白激酶1（receptorinteraction protein kinase1,RIP1）及受體相互作用蛋白激酶3（receptor interactionprotein kinase3,RIP3）在谷氨酸誘導的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）與海馬神經(jīng)元（HT22）毒性中發(fā)揮的作用。 【研究方法】在用谷氨酸或TNF-誘導后，檢測野生型及RIP3缺失型小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）以及HT22細胞的存活率，以探明它們對谷氨酸或TNF-的敏感度。通過siRNA干擾將TNF-誘導的壞死通路中的關(guān)鍵蛋白RIP1沉默，或通過藥物necrostatin-1預處理，后加入谷氨酸或TNF-誘導，觀察RIP1的下調(diào)與necrostatin-1預處理對谷氨酸或TNF-誘導的細胞死亡的影響是否一致。并用western blot檢測其siRNA的干擾效率。利用RIP3缺失的MEF細胞，以及通過用siRNA干擾降低RIP3表達的HT22細胞，檢測RIP3的缺失或下調(diào)對谷氨酸或TNF-誘導的細胞死亡的影響，以判斷TNF-誘導壞死的關(guān)鍵蛋白RIP3是否參與谷氨酸誘導的細胞死亡信號通路。通過siRNA干擾的方法下調(diào)線粒體蛋白凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）的表達，，以判斷AIF在谷氨酸或TNF-誘導的細胞死亡中的作用；通過使用自噬及溶酶體的化學抑制劑balfilomycin-A1(BFA)，Chloroquine (CQ)，3-Methyladenine(3-MA)以及活性氧ROS的化學抑制劑butylated hydroxyanisole (BHA)，N-acetylcysteine (NAC)以判斷谷氨酸或TNF-誘導的細胞死亡與自噬或溶酶體及活性氧的關(guān)系。 【研究結(jié)果】1）在HT22和MEF細胞中，necrostatin-1都能夠有效阻止谷氨酸誘導的細胞死亡,而且凋亡抑制蛋白z-VAD能促進此細胞死亡。2）在MEF和HT22細胞中，利用RNAi沉默necrostatin-1的靶蛋白RIP1能夠抑制腫瘤壞死因子TNF-誘導的細胞壞死，但不影響谷氨酸誘導的細胞毒性。3）與RIP1相互作用的細胞壞死調(diào)控蛋白RIP3的敲除不能抑制谷氨酸誘導的MEF細胞死亡，但能完全阻止TNF-誘導的細胞壞死，而且，RIP3的RNAi不能抑制谷氨酸誘導的HT22細胞死亡。4）線粒體凋亡誘導因子AIF的沉默不能阻止谷氨酸誘導的HT22細胞死亡以及MEF細胞死亡。5）自噬/溶酶體抑制劑BFA和3-MA等能有效阻止谷氨酸誘導的細胞死亡，但不影響TNF-誘導的細胞壞死。6）活性氧抑制劑BHA和NAC能抑制谷氨酸以及TNF-誘導的細胞壞死。 【結(jié)論】綜上所述，這些結(jié)果不僅首次證實了necrostatin-1阻止谷氨酸誘導的細胞死亡的靶點并不是RIP1，同時也提出，谷氨酸誘導的細胞死亡并不依賴于TNF誘導的細胞壞死下游的RIP1，RIP3。另外也進一步揭示其與溶酶體自噬泡的關(guān)系，并且活性氧也可能參與其下游損傷機制。
【關(guān)鍵詞】：Necrostatin-1 RIP1 RIP3 HT22 MEF 谷氨酸
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-20
• 一．材料11-14
• 二. 方法14-20
• 結(jié)果20-28
• 1. 谷氨酸對 MEF 與 HT22 細胞的毒性作用20-21
• 2. Necrostatin-1 保護谷氨酸誘導的細胞損傷的作用靶點不是 RIP121-23
• 3. 谷氨酸誘導的 MEF 與 HT22 細胞的毒性作用不依賴于 RIP323-25
• 4. AIF 的沉默不能抑制谷氨酸誘導的細胞毒性25-26
• 5. 谷氨酸誘導的細胞毒性與溶酶體及自噬泡的形成有關(guān)26
• 6. 活性氧 ROS 參與了谷氨酸誘導的細胞損傷26-28
• 討論28-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻31-34
• 綜述 谷氨酸的細胞毒性研究進展34-49
• 綜述參考文獻41-49
• 攻讀學位期間本人出版和公開發(fā)表的論著、論文49-50
• 致謝50-51

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