本文關(guān)鍵詞：MVA-Ag85B-TB10.4和MVA-tPA-Ag85B-TB10.4結(jié)核疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核疫苗 Ag85B TB10.4 MVA tPA信號(hào)肽

【摘要】：結(jié)核病作為一種人類疾病大約出現(xiàn)在70000年前的非洲，而其病原體結(jié)核分枝桿菌也被發(fā)現(xiàn)超過(guò)一個(gè)世紀(jì)。但如今，，結(jié)核病仍然是困擾人類的一個(gè)重大疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2012年，全世界新增860萬(wàn)結(jié)核病患者，并有130萬(wàn)人因結(jié)核病而死亡。目前唯一被廣泛應(yīng)用的結(jié)核桿菌疫苗卡介苗，對(duì)于成人的保護(hù)效果并不好，所以新型有效結(jié)核疫苗的研發(fā)迫在眉睫。結(jié)核桿菌有眾多的分泌蛋白，其中一些已被證明具有良好的免疫原性，并在一些疫苗中得到了應(yīng)用。Ag85B蛋白即為一種被眾多新型結(jié)核疫苗采用的抗原蛋白，是Fbp蛋白家族中的一員，能夠幫助分枝桿菌粘附到粘膜表面，從而促進(jìn)其進(jìn)入宿主細(xì)胞。TB10.4是ESAT 6家族中的一員，其是分枝桿菌鐵、鋅離子的攝入通道，為結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)所必需。病毒載體在目前的疫苗研究中也越來(lái)越被重視，其中痘病毒載體由于其良好的免疫原性和優(yōu)秀的安全性，被認(rèn)為是很好的候選疫苗載體。 本研究中，應(yīng)用痘病毒載體MVA構(gòu)建了表達(dá)Ag85B TB10.4融合蛋白的重組結(jié)核疫苗MVA Ag85B TB10.4。并為了提高蛋白的表達(dá)量，通過(guò)在Ag85B TB10.4的N端引入組織纖溶酶原激活因子前導(dǎo)信號(hào)肽tPA，構(gòu)建了MVA tPA Ag85B TB10.4，以期產(chǎn)生更好的免疫效果。具體的研究?jī)?nèi)容如下： 第一，通過(guò)PCR得到Ag85B TB10.4和含有tPA信號(hào)肽、HA標(biāo)簽的Ag85B TB10.4基因，將其連接到pcDNA3.1( )表達(dá)載體上，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，檢測(cè)表達(dá)量。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，Ag85B TB10.4基因在細(xì)胞內(nèi)能夠正常表達(dá)，同時(shí)tPA信號(hào)肽對(duì)蛋白表達(dá)量的提高有明顯作用。 第二，將Ag85B TB10.4基因和tPA Ag85B TB10.4基因通過(guò)穿梭質(zhì)粒pSC11M1重組到MVA中，篩選得到MVA Ag85B TB10.4和MVA tPA Ag85B TB10.4兩個(gè)病毒株。通過(guò)對(duì)感染的BHK TK 細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，證明重組病毒株能夠正常表達(dá)外源蛋白。 第三，將兩株病毒擴(kuò)增純化，檢測(cè)滴度后，免疫Balb/c小鼠，另免疫M(jìn)VA Blank和PBS作為對(duì)照組。兩次免疫后檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。結(jié)果顯示，抗原蛋白和肽刺激后， MVA Ag85B TB10.4誘導(dǎo)產(chǎn)生了較弱的IFN γ分泌，而MVA tPA Ag85B TB10.4無(wú)論在全蛋白刺激下，還是各種表位肽刺激下產(chǎn)生的IFN γ都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MVA Ag85B TB10.4，證明tPA信號(hào)肽的修飾對(duì)疫苗免疫后的應(yīng)答水平有較好的增強(qiáng)作用。 本研究對(duì)MVA Ag85B TB10.4和MVA tPA Ag85B TB10.4兩種結(jié)核疫苗的免疫效果進(jìn)行了考察，初步證實(shí)了tPA信號(hào)肽對(duì)于免疫應(yīng)答有增強(qiáng)效果。但在tPA信號(hào)肽的具體作用機(jī)制及疫苗的保護(hù)效果等方面，仍需進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核疫苗 Ag85B TB10.4 MVA tPA信號(hào)肽
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 結(jié)核病簡(jiǎn)介12-14
• 1.1.1 結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌12
• 1.1.2 結(jié)核病的現(xiàn)狀12-14
• 1.2 結(jié)核分枝桿菌14-18
• 1.2.1 結(jié)核分枝桿菌特點(diǎn)14-15
• 1.2.2 結(jié)核桿菌感染過(guò)程15-16
• 1.2.3 結(jié)核分枝桿菌的毒力因子16-18
• 1.2.3.1 Ag85B16-17
• 1.2.3.2 TB10.417-18
• 1.3 結(jié)核疫苗現(xiàn)狀18-20
• 1.4 tPA 信號(hào)肽20
• 1.5 本研究的設(shè)計(jì)思路20-21
• 第2章 重組質(zhì)粒構(gòu)建與真核表達(dá)21-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.1.2 質(zhì)粒與酶21
• 2.1.3 試劑與溶液配制21-23
• 2.1.3.1 菌種培養(yǎng)及保存相關(guān)溶液21-22
• 2.1.3.2 抗生素溶液22
• 2.1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳溶液22
• 2.1.3.4 SDS-PAGE 凝膠電泳所用試劑22-23
• 2.1.3.5 Western-Blot 試劑23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-28
• 2.2.1 序列設(shè)計(jì)23-25
• 2.2.2 PCR 擴(kuò)增目的片段25-26
• 2.2.3 重組 p-GEM-T-easy 克隆載體的構(gòu)建26-27
• 2.2.4 重組 pcDNA3.1(-)與 pSC11M1 質(zhì)粒構(gòu)建27
• 2.2.5 真核表達(dá)重組pcDNA3.1(-)質(zhì)粒27-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-31
• 2.3.1 PCR 擴(kuò)增目的片段結(jié)果28
• 2.3.2 重組 p-GEM-T-easy 克隆質(zhì)粒結(jié)果28-29
• 2.3.3 重組 pcDNA3.1(-)與 pSC11M1 質(zhì)粒結(jié)果29-30
• 2.3.4 真核表達(dá) Western-Blot 結(jié)果30-31
• 2.4 本章小結(jié)31-33
• 第3章 重組 MVA 載體疫苗的制備33-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器33
• 3.1.2 試劑33
• 3.1.3 細(xì)胞系與病毒株33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 3.2.1 MVA 重組34
• 3.2.2 重組 MVA 的篩選34-35
• 3.2.3 重組 MVA 的檢測(cè)35-36
• 3.2.3.1 PCR 檢測(cè)35-36
• 3.2.3.2 Western-Blot 檢測(cè)36
• 3.2.4 重組 MVA 的擴(kuò)增36-37
• 3.2.5 重組 MVA 的純化37
• 3.2.6 重組 MVA 滴度的測(cè)定37-38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 3.3.1 MVA 重組檢測(cè)38
• 3.3.2 重組 MVA 的篩選檢測(cè)結(jié)果38-40
• 3.3.3 重組 MVA 蛋白表達(dá)量檢測(cè)40
• 3.3.4 MVA 病毒滴度檢測(cè)40-41
• 3.4 本章小結(jié)41-42
• 第4章 重組 MVA 病毒的免疫原性研究42-53
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• 4.1.2 儀器試劑42-43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 4.2.1 動(dòng)物免疫方案43
• 4.2.2 脾淋巴細(xì)胞分離43-44
• 4.2.3 T 細(xì)胞亞群分群44-45
• 4.2.4 T-cell 增殖及細(xì)胞因子檢測(cè)45
• 4.2.5 ELISPOT 檢測(cè)刺激后脾細(xì)胞 IFN-γ的分泌45-46
• 4.2.6 CTL 體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)46-47
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-52
• 4.3.1 CTL 體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-48
• 4.3.2 ELISPOT 檢測(cè) IFN-γ的分泌48-50
• 4.3.3 FCM 檢測(cè) T 細(xì)胞亞群分布50-52
• 4.4 本章小結(jié)52-53
• 第5章 結(jié)論53-55
• 5.1 討論53-54
• 5.2 結(jié)論54
• 5.3 展望54-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 致謝57

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