本文關鍵詞：肺炎克雷伯菌CRP突變株的構建及其生物膜表型分析

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【摘要】：背景：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是一種革蘭陰性桿菌。該菌在自然界分布廣泛，是一種重要的條件致病菌，常常引發(fā)社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院內感染。近年來，在常見的革蘭陰性菌感染病例中，肺炎克雷伯菌已成為了僅次于大腸桿菌的重要條件致病菌，引起的感染類型主要包括敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染和呼吸道感染。各種引起患者機體免疫力下降的因素都可以導致肺炎克雷伯菌感染，包括對激素藥物、免疫抑制劑和抗代謝藥物的使用，患者自身患有基礎性疾病和采用侵入性的手術治療方式。并且，肺炎克雷伯菌可通過病人之間、病人與醫(yī)護人員和醫(yī)療用具的相互接觸而發(fā)生感染。為了更好的預防和治療由肺炎克雷伯菌引起的感染，有必要對它的致病機制進行深入的研究。 生物膜的形成使得肺炎克雷伯菌能夠長期地適應并生存在宿主環(huán)境中，從而免于被血清因子殺滅和吞噬而傳播廣泛。cAMP受體蛋白（cyclic AMP receptor protein, CRP)可與cAMP相結合而影響著眾多毒力基因的表達,其中包括參與肺炎克雷伯菌生物膜形成相關基因的轉錄表達過程。因此，推測肺炎克雷伯菌crp基因的缺失可能也會影響菌體的生物膜形成能力，繼而影響該菌的毒力及致病性。 目的：建立一種可行的肺炎克雷伯菌基因無痕敲除方法，為在分子水平上進一步了解該菌毒力和致病性相關靶基因的調節(jié)機制奠定基礎。另外，，驗證突變株的表型與CRP基因缺失的對應關系，分析回補株的表型能否回復到野生株的狀態(tài)。 方法：1.首先利用無痕敲除的方法構建突變株。依據(jù)肺炎克雷伯菌NTUH-K2044的基因組序列，設計用于擴增crp基因兩側同源臂的引物，PCR擴增得到兩側同源片段，用融合PCR的方法得到同源臂融合片段，酶切后克隆到自殺質粒pKO3-km中，得到重組質粒pKO3-km-crp。利用同源重組的方法，得到crp基因缺失的突變株Δcrp。2.回補株的構建。PCR擴增得到crp基因片段，酶切處理后的crp片段克隆到載體pGEM-T-easy-km上，構建得到回補質粒pGEM-T-easy-km-crp。將回補質粒轉入突變株Δcrp中，得到回補株C-Δcrp。3.生物膜表型的測定。用結晶紫染色法分別測定突變株，回補株和野生株的生物膜形成量，計算出它們各自的均值和標準差。 結果：建立了一種肺炎克雷伯菌無痕敲除的方法，并成功構建了肺炎克雷伯菌突變株crp，突變株基因組內無任何抗性篩選標記殘留。利用質粒pGEM-T-easy-km構建得到回補質粒，經測序正確后，轉入突變株中，獲得回補株C-Δcrp。對野生株、突變株和回補株的生物膜形成能力進行測定，結果表明突變株的生物膜形成量少于回補株和野生株，且回補株能夠部分回復突變株的生物膜形成能力。 結論：crp基因缺失可以減弱肺炎克雷伯菌的生物膜形成能力，表明crp可能參與正向調控肺炎克雷伯菌生物膜形成相關基因的轉錄表達，從而影響肺炎克雷伯菌生物膜形成。回補株C-Δcrp的生物膜表型可以部分回復到野生株的狀態(tài)，表明crp基因與肺炎克雷伯菌的生物膜形成具有一一對應的關系，從而為進一步研究crp基因影響肺炎克雷伯菌生物膜的形成機制提供可能。
【關鍵詞】：肺炎克雷伯菌 cAMP受體蛋白 基因敲除 生物膜
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-17
• 第一部分 構建重組質粒 pKO3-km- crp 和突變株Δcrp17-28
• 第一節(jié) 同源臂擴增17-21
• 1 材料和方法17-19
• 2 結果及討論19-21
• 第二節(jié) 構建重組質粒 pKO3-km-Δcrp21-24
• 1 材料與方法21-23
• 2 結果及討論23-24
• 第三節(jié) 同源重組24-28
• 1 材料與方法24-25
• 2 結果及討論25-28
• 第二部分 回補質粒 pGEM-T-easy-km-c- crp 和回補株 C-Δcrp 的構建28-30
• 1 材料與方法28
• 2 結果及討論28-30
• 第三部分 生物膜形成試驗30-35
• 1 材料與方法30-31
• 2 結果及討論31-35
• 全文小結35-36
• 參考文獻36-39
• 文獻綜述39-45
• 參考文獻42-45
• 致謝45-46
• 攻讀學位期間發(fā)表學術論文及參與課題46-47

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 郝家硯;程邦寧;;產ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子介導耐藥的研究[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2014年01期

2 杜紅梅;顧挺;古麗娜爾·沙丁;;新生兒下呼吸道感染患者產ESBLs菌株的耐藥性分析[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2014年08期

3 趙紅霞;軒凱;;臨床分離多重耐藥菌感染類型及變化趨勢[J];中國感染控制雜志;2014年06期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 董方聰;潰瘍性結腸炎和菌血癥的代謝組NMR研究[D];中國科學院研究生院（武漢物理與數(shù)學研究所）;2013年

2 楊仕t

本文編號：819094