本文關(guān)鍵詞：NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： NRAGE 敲除小鼠 破骨細(xì)胞分化 成骨細(xì)胞 基因芯片

【摘要】：骨代謝的穩(wěn)態(tài)由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同維持的,其中,破骨細(xì)胞是骨轉(zhuǎn)換的啟動(dòng)者。大多數(shù)骨質(zhì)疏松的發(fā)生與破骨細(xì)胞的過(guò)渡分化和活性增強(qiáng)相關(guān)。破骨細(xì)胞調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,多條信號(hào)通路涉及的多種受體、接頭蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等均已被證明可以直接或間接地調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。NRAGE (neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog)即黑色素瘤相關(guān)抗原,作為細(xì)胞內(nèi)接頭蛋白,已被證明可通過(guò)不同的信號(hào)通路影響細(xì)胞的存活、增殖、凋亡和分化等多種活動(dòng)。我們前期實(shí)驗(yàn)表明,NRAGE基因敲除可明顯促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化,但其機(jī)制尚不清楚。鑒于此,本論文從直接作用(RANKL和M-CSF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化)和間接作用(即成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞的影響)兩方面探討了NRAGE影響破骨細(xì)胞分化的可能調(diào)控機(jī)制。第一部分：NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞的直接調(diào)控作用及機(jī)制研究(1)前期實(shí)驗(yàn)表明,NRAGE基因敲除能夠明顯促進(jìn)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。本論文擴(kuò)大樣本量(n=6),通過(guò)TRAP染色確證了NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞分化的直接調(diào)控作用,Q-PCR擴(kuò)增破骨細(xì)胞分化過(guò)程中NRAGE的表達(dá)也進(jìn)一步明確了NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控作用。(2)利用Q-PCR,我們分析了在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中,兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子c-fos和NFATc1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),NRAGE敲除后能夠明顯提高c-fos和NFATc1的表達(dá),而且RANKL處理后,NRAGE敲除組提高更為明顯。(3)MAPK(ERK1/2,p38和JNK)是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的經(jīng)典信號(hào)通路,其中p38和JNK信號(hào)通路的激活可上調(diào)破骨細(xì)胞中c-fos和NFATc1的表達(dá)。同時(shí),在細(xì)胞凋亡的研究中,NRAGE被證明參與ERK1/2, p38和JNK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。鑒于此,我們分離了敲除組和野生組骨髓單核細(xì)胞,用RANKL和M-CSF處理不同的時(shí)間段(0,5,15和30分鐘),收集蛋白,Western blot分析ERK1/2,p38和JNK的磷酸化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NRAGE敲除組ERK1/2, p38和JNK的磷酸化水平并沒(méi)有明顯提高,提示NRAGE敲除對(duì)破骨細(xì)胞分化的直接促進(jìn)作用并不是通過(guò)MAPK(ERK1/2, p38和JNK)通路而實(shí)驗(yàn)的。NRAGE敲除后對(duì)c-fos和NFATc1的表達(dá)的上調(diào)和破骨細(xì)胞的分化促進(jìn)作用可能是通過(guò)NF-κB(前期已經(jīng)證明,見(jiàn)許麗娟論文),亦或其他尚未檢測(cè)的信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。第二部分：NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞的間接調(diào)控作用及機(jī)制研究前期實(shí)驗(yàn)表明,NRAGE可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和活性,活性提高的成骨細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,但是機(jī)制并不清楚。為此,本論文分離純化了敲除組和對(duì)照組新生鼠顱骨細(xì)胞,并進(jìn)行了成骨分化誘導(dǎo)(抗壞血酸,終濃度50μg/mL+β-甘油磷酸鈉,終濃度10mM),將誘導(dǎo)分化7天的成骨細(xì)胞和未誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析,經(jīng)Q-PCR驗(yàn)證表明,該基因芯片可靠性較好。利用FatiGO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因的分子功能和生物功能分析,并結(jié)合文獻(xiàn)查閱,發(fā)現(xiàn)NRAGE基因敲除組與野生組比較,在可能與骨發(fā)育或骨代謝相關(guān)的基因中,2倍上調(diào)基因43個(gè),2倍下調(diào)基因41個(gè)。采用Biocarta數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)差異表達(dá)基因信號(hào)通路分析表明,差異表達(dá)基因主要集中在炎癥、細(xì)胞因子和趨化因子以及Wnt等信號(hào)通路上。根據(jù)基因芯片的提示,我們從Wnt信號(hào)通路、炎性因子,以及經(jīng)典的RANKL/OPG的比率等方面,分析了NRAGE敲除后成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化影響的可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)Wnt5a刺激后,NRAGE敲除組和野生組破骨細(xì)胞分化并沒(méi)有明顯改變,提示W(wǎng)nt5a介導(dǎo)的信號(hào)通路沒(méi)有參與NRAGE敲除后的破骨分化增強(qiáng)過(guò)程。(2)Q-PCR擴(kuò)增不同分化階段的成骨細(xì)胞(敲除組和野生組)中炎性因子(Ccl2、Cox-2、 Cxcl1、Cxcl5、IL-6、KC)的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分炎癥因子在敲除組中的表達(dá)都高于野生組,尤其在成骨分化前期(day0和day7),炎性因子提高程度更為明顯,提示：NRAGE敲除后可能增強(qiáng)了成骨細(xì)胞炎性因子的合成,從而進(jìn)一步促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化。(3) RANKL/OPG比率是判斷成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化影響的一個(gè)重要指標(biāo)。Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示,NRAGE敲除后,OPG在成骨分化整個(gè)過(guò)程中表達(dá)明顯下調(diào),而RANKL在成骨分化早期(day0)和后期(day28)表達(dá)上調(diào),在day7和dayl4表達(dá)沒(méi)有明顯改變。其RANKL/OPG比率在NRAGE基因敲除小鼠成骨細(xì)胞整個(gè)分化過(guò)程中明顯上調(diào),這可能是NRAGE基因敲除小鼠成骨細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的一個(gè)重要機(jī)制之一。主要結(jié)論：1. NRAGE基因敲除可直接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,影響破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-fos和NFAT1明顯上調(diào),但破骨細(xì)胞的分化增強(qiáng)和c-fos、NFATcl的上調(diào)作用并不是通過(guò)MAPK(ERKl/2, p38和JNK)來(lái)實(shí)現(xiàn)。2. NRAGE敲除后,其成骨細(xì)胞可間接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,成骨細(xì)胞炎性因子合成的增強(qiáng)和RANKL/OPG比率的提高可能成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞影響的重要機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：NRAGE 敲除小鼠 破骨細(xì)胞分化 成骨細(xì)胞 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 英文縮寫詞表4-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-24
• 第一部分 NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的直接調(diào)控作用及機(jī)制研究24-44
• 1. 材料24-27
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 4. 討論41-44
• 第二部分 NRAGE對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的間接調(diào)控作用及機(jī)制研究44-72
• 1. 材料44-47
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法47-53
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-69
• 4. 討論69-72
• 全文總結(jié)72-73
• 附錄一73-75
• 附錄二75-96
• 研究生期間發(fā)表的文章96-97
• 致謝97-99
• 參考文獻(xiàn)99-102

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