發(fā)布時(shí)間：2017-09-07 22:20

  本文關(guān)鍵詞：ICOSL分子的克隆表達(dá)及ICOSL核糖體單鏈抗體庫的構(gòu)建及篩選

  更多相關(guān)文章： ICOSL 核糖體展示 單鏈抗體 急慢性排異反應(yīng)

【摘要】：本研究旨在通過運(yùn)用核糖體展示技術(shù),在鼠源性單鏈抗體庫中篩選出抗ICOSL的特異性抗體,以期在減輕器官移植的排異反應(yīng)方面能有更廣闊的應(yīng)用。 第一,通過RT-PCR從人B淋巴瘤細(xì)胞Daudi的總RNA中擴(kuò)增出ICOSL胞外區(qū)基因,并將此基因插入到原核表達(dá)載體pET28a中進(jìn)行表達(dá)。 第二,以表達(dá)純化的ICOSL蛋白為抗原免疫Balb/c、鼠,每兩周免疫一次,共免疫4次。免疫后,取小鼠脾臟提取總RNA,通過RT-PCR擴(kuò)增小鼠的重鏈可變區(qū)和Linker (VH-linker)序列,以及輕鏈可變區(qū)和Linker (Vκ-linker)序列。經(jīng)重組PCR將兩段基因連接起來,將VH/κ與pMD19-T載體鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a, PCR鑒定并測序。 第三,通過核糖體展示技術(shù),使抗ICOSL單鏈抗體庫經(jīng)過體外翻譯,形成“單鏈抗體—核糖體—mRNA"三元復(fù)合物。并用BAFF-His蛋白進(jìn)行負(fù)篩,再將ICOSL蛋白做抗原,進(jìn)行3輪正篩,從而獲得抗ICOSL的特異性單鏈抗體基因序列,并將此序列嵌入到PET43.1a表達(dá)載體中進(jìn)行蛋白表達(dá)。 最后,對表達(dá)出來的蛋白進(jìn)行間接ELISA檢測,從而篩選出高效表達(dá)目的蛋白的克隆菌株。將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化得到抗ICOSL單鏈抗體,并經(jīng)Western blot檢測其特異性。 本研究以重組ICOSL胞外區(qū)蛋白為抗原構(gòu)建抗ICOSL單鏈抗體庫,并通過核糖體展示篩選獲得單鏈抗體,經(jīng)過特異性與活性的檢測,我們成功的篩選得到了對ICOSL具有高親和的單鏈抗體。為抗ICOSL單鏈抗體的人源化改造,并利用其治療器官移植引起的急慢性排異反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：ICOSL 核糖體展示 單鏈抗體 急慢性排異反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞表3-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 參考文獻(xiàn)12-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-43
• 第一章 ICOSL的研究進(jìn)展14-23
• 1.1 ICOSL及其受體ICOS的結(jié)構(gòu)14-16
• 1.2 ICOSL的分布與表達(dá)16
• 1.3 ICOSL的生物學(xué)功能及其信號傳導(dǎo)的研究16-18
• 1.4 ICOSL在疾病方面的研究18-20
• 1.4.1 ICOSL對自身免疫性疾病的影響18-19
• 1.4.2 ICOSL對器官移植排異反應(yīng)的影響19-20
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第二章 單鏈抗體的表達(dá)及應(yīng)用23-33
• 2.1 單鏈抗體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性23-24
• 2.1.1 單鏈抗體的構(gòu)建23
• 2.1.2 單鏈抗體的生物學(xué)特性23-24
• 2.2 單鏈抗體的表達(dá)系統(tǒng)24-26
• 2.2.1 原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)24-25
• 2.2.2 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)25
• 2.2.3 酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)25-26
• 2.2.4 植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)26
• 2.2.5 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)26
• 2.3 單鏈抗體的應(yīng)用26-29
• 2.3.1 在生物學(xué)方面的應(yīng)用26-27
• 2.3.2 在基因治療方面的應(yīng)用27
• 2.3.3 在腫瘤診斷方面的應(yīng)用27-28
• 2.3.4 在腫瘤治療方面的應(yīng)用28-29
• 2.3.5 在抗器官移植排異反應(yīng)方面的應(yīng)用29
• 2.4 單鏈抗體的前景與展望29-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 第三章 核糖體展示技術(shù)的建立及應(yīng)用33-43
• 3.1 核糖體展示技術(shù)概述33-34
• 3.2 核糖體展示技術(shù)的原理34
• 3.3 核糖體展示技術(shù)的具體過程34-38
• 3.3.1 核糖體展示基因文庫的構(gòu)建35-36
• 3.3.2 核糖體展示技術(shù)中的體外轉(zhuǎn)錄與翻譯36-37
• 3.3.3 核糖體展示技術(shù)中的親和篩選與篩選效率的測定37-38
• 3.4 核糖體展示技術(shù)的應(yīng)用38-39
• 3.4.1 在多肽篩選方面的應(yīng)用38-39
• 3.4.2 在篩選抗體方面的應(yīng)用39
• 3.4.3 在酶方面的應(yīng)用39
• 3.5 核糖體展示技術(shù)的應(yīng)用前景及展望39-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究43-73
• 第一章 ICOSL分子胞外區(qū)的克隆表達(dá)44-53
• 摘要44-45
• Abstract45-46
• 1 材料與方法46-48
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑配置46
• 1.2 試驗(yàn)方法46-48
• 2 結(jié)果與分析48-50
• 2.1 ICOSL基因全長的擴(kuò)增48-49
• 2.2 ICOSL胞外區(qū)基因的擴(kuò)增49
• 2.3 ICOSL胞外區(qū)基因的克隆與表達(dá)49-50
• 3 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-53
• 第二章 抗ICOSL核糖體展示單鏈抗體庫的構(gòu)建53-62
• 摘要53-54
• Abstract54-55
• 1 材料與方法55-58
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑配置55
• 1.2 試驗(yàn)方法55-58
• 2 結(jié)果與分析58-59
• 2.1 ELISA分析58
• 2.2 小鼠脾臟總RNA的提取58-59
• 2.3 VH-linker、VK-linker鏈以及VH-linker-κ鏈的擴(kuò)增59
• 3 討論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-62
• 第三章 核糖體展示技術(shù)篩選抗ICOSL單鏈抗體62-73
• 摘要62-63
• Abstract63-64
• 1 材料與方法64-67
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料64-65
• 1.2 試驗(yàn)方法65-67
• 2 結(jié)果與分析67-70
• 2.1 體外轉(zhuǎn)錄與翻譯67
• 2.2 單鏈抗體基因的親和性鑒定67-68
• 2.3 單鏈抗體的表達(dá)純化及活性堅(jiān)定68-69
• 2.4 克隆菌株的序列分析69-70
• 3 討論70-72
• 參考文獻(xiàn)72-73
• 全文結(jié)論73-74
• 致謝74-75
• 附錄75
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 武國軍,郝曉柯;單鏈抗體的研究進(jìn)展及在腫瘤診斷、治療中的應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊);1999年01期

2 李文秀;周鳳云;毛偉平;潘楊濱;何志娟;徐，

本文編號：810221